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a-淀粉酶为内切型淀粉酶,能够以淀粉为底物,从淀粉内部水解1,4-a-D-葡萄糖苷键。耐高温淀粉酶更广泛应用于淀粉加工、制糖、味精、酒精、啤酒、柠檬酸、纺织印染以及其它发酵工业,具有巨大的经济价值。在使用时通常a-淀粉酶需要与糖化酶配合使用,依次对淀粉原料进行液化和糖化处理,整个过程中控制浆液的pH值是一个关键因素。通常从磨坊出来的淀粉浆料自然pH值为4.5左右,而目前广泛应用的高温a-淀粉酶最适pH值为6.0～6.2,在pH5.0以下酶活性很低,而来源于黑曲霉的糖化酶作用最适pH值为4.2～4.5,所以在淀粉液化和糖化过程中需要反复用酸碱调整pH值,这样不仅提高了浆液中的离子浓度,而且调节不当会产生大量的副产物,影响发酵效率,增加了后续工艺的复杂程度。如果在生产工艺中使用耐酸性的高温淀粉酶则可以简化工业流程、节省生产成本、减少环境污染,可在以淀粉为原料的发酵工业中发挥巨大作用。因此开发一种最适pH值与糖化酶最适pH值相仿的高温酸性a-淀粉酶是目前的研究热点。
2002年,Richardson从环境微生物DNA文库中克隆到的一系列可能来源于一种嗜热球菌属(Thermococcus)的高温酸性a-淀粉酶基因,并通过定向进化筛选到一个的高温酸性a-淀粉酶的人工突变体BD5088,在荧光假单胞菌pseudomonas fluorescens获得表达。基因BD5088全长1311 bp,编码437个氨基酸,蛋白质的理论分子量约48 kD,肽链上不存在任何潜在N-连接糖基化位点。最适pH 4.5,最适温度95℃,活性不依赖于Ca2+存在,是一种高温酸性a-淀粉酶,其综合性质均优于其它野生型基因,具有较大的应用潜力。
为了能达到生产的目的,本研究利用DNAWORKS3.0软件,按照巴斯德毕赤酵母密码子的偏好性,将其密码子进行优化设计,设计用于PCR合成BD5088基因的引物,通过两步PCR法合成了BD5088基因,分别将其与质粒pET-30a和pHBM905B连接.将正确构建的重组质粒pET-BD5088转化大肠杆菌BL-21细胞,在IPTG的诱导下,该基因在大肠杆菌中得到了表达,SDS-PAGE分析表达产生的蛋白大约为48kD,与预计的a-淀粉酶的大小相一致。表达产生的a-淀粉酶的最适反应温度为80℃,在100℃下酶活性半衰期约30 min。最适反应pH值为5.6-6.0,在pH5-6.4范围内酶活性保留90％以上,不依赖于Ca2+。
将正确构建的重组质粒转化毕赤酵母GS115细胞,该基因在酵母细胞中也得到了表达。在酵母a-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,该a-淀粉酶在毕赤酵母中大量表达并分泌到胞外。该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导,随着诱导培养时间的增加在培养基上清液中的单位体积酶活力相应上升,在诱导培养五天后酶活力达到最大值。但该酶的性质发生了变化,最适温度降为70℃,最适反应pH值为5.6,可能是由于受到糖基化的影响,有待进一步实验证实。