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研究背景:Kupffer细胞(Kupffer cells,KCs)内毒素耐受现象与全身炎症反应综合症等临床感染性疾病的发生密切相关。抑制巨噬细胞中核转录因子κB(nuclear transcriptional factor kappa B,NF-κB)的活性是诱导机体内毒素耐受最有效的方式之一。据报道,磷脂酰肌醇3-激酶γ(phosphoinositide 3-kinaseγ,PI3Kγ)在受到脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后,一方面能使Toll样受体4(toll-like receptor,TLR4)的亚细胞区室化,限制TLR4炎症信号传导,抑制促炎因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)的分泌以及增强抗炎因子如白介素10(interleukin,IL-10)等的分泌,以抑制机体炎症反应。另一方面,PI3Kγ/AKT被激活后可直接磷酸化叉头蛋白O3a(fork head protein O3a,Foxo3a),并通过p53-鼠双微体蛋白2(murine double mimute,MDM2)泛素化水解foxo3a,从而解除了Foxo3a对NF-κB活性的抑制作用,促进炎症信号的转导。上述两种相互矛盾的现象,提示PI3Kγ/AKT通路在调控内毒素炎症信号传导过程中可能受到来自下游foxo3a和p53/MDM2通路的负反馈调节。但是,foxo3a和p53/MDM_____________________________________本课题受国家自然科学基金资助(No.81701950)通路在KCs内毒素耐受过程中存在何种相互作用关系,以及foxo3a和p53/MDM通路是否是PI3Kγ/AKT通路调控KCs内毒素耐受的平衡机制,目前尚不清楚。因此,本实验将研究PI3Kγ/AKT、foxo3a、p53/MDM在体内外KCs内毒素耐受模型的作用及相互作用的关系。方法:1.分离和培养KCs,建立KCs内毒素耐受和非耐受模型:(1)、利用酶联免疫吸附试法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测细胞上清中TNF-α和IL-10的含量;(2)、蛋白免疫印迹法(western blotting,WB)检测NF-κB p65和Foxo3a蛋白表达和磷酸化水平;(3)、细胞免疫荧光法观察NF-κB p65和Foxo3a在KCs定位变化的情况。利用Foxo3a-小干扰RNA质粒(Foxo3a small interfering RNA plasmid,Foxo3a-siRNA)和Foxo3a过表达质粒(Foxo3a overexpression plasmid,Foxo3a-OE)分别转染体外KCs 36 h后,再建立KCs内毒素耐受和非耐受模型:(1)、利用ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-10的含量;(2)、WB法检测NF-κB p65和Foxo3a蛋白表达和磷酸化水平;(3)、利用流式细胞仪结合碘化丙啶(propidium iodide,PI)/异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的膜联蛋白annexinⅤ法检测KCs凋亡情况。2.分离和培养KCs,建立KCs内毒素耐受和非耐受模型后,利用WB法分别检测PI3Kγ和AKT的蛋白表达和磷酸化水平。PI3Kγ激动剂重组小鼠胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)蛋白和抑制剂IPI-549预处理KCs后,再建立KCs内毒素耐受和非耐受模型:(1)、利用ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-10的含量;(2)、WB检测NF-κB p65和Foxo3a蛋白表达和磷酸化水平;(3)、利用全自动细胞计数仪检测KCs生存率。利用Foxo3a Foxo3a-OE转染体外KCs36 h,然后利用PI3Kγ激动剂IGF-1预处理KCs,再建立KCs内毒素非耐受模型;或者利用Foxo3a-siRNA转染体外KCs 36 h,然后利用抑制剂IPI-549预处理KCs,再建立KCs内毒素耐受模型;(1)、利用ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-10的含量;(2)、WB法检测NF-κB p65和Foxo3a蛋白表达和磷酸化水平;(3)、利用全自动细胞计数仪检测KCs生存率。利用PI3Kγ激动剂IGF-1和抑制剂IPI-549预处理清洁级小鼠后,再建立小鼠内毒素耐受和非耐受模型:(1)、观察和记录小鼠生存时间;(2)、苏木素伊红染色法(haematoxylin-eosin staining,HE)结合Suzuki评分表评估肝脏组织炎症反应程度;(3)、分离肝脏的KCs后,利用定量聚合酶链反应法(real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR),RT-PCR)分别检测TNF-α和IL-10的mRNA表达水平,以及WB法检测NF-κB p65和Foxo3a蛋白表达和磷酸化水平。3.分离和培养KCs,利用Foxo3a-OE转染体外KCs 36 h后,再利用WB法分别检测p53和MDM2的蛋白表达和磷酸化水平。分离和培养KCs,建立KCs内毒素耐受和非耐受模型后,利用WB法分别检测p53和MDM2的蛋白表达和磷酸化水平。利用MDM2-siRNA转染体外KCs 36 h后,再建立KCs内毒素非耐受模型:(1)、利用ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-10的含量;(2)、WB法检测NF-κB p65和Foxo3a蛋白表达和磷酸化水平;(3)、利用全自动细胞计数仪检测KCs生存率。PI3Kγ激动剂IGF-1预处理KCs,然后利用MDM2抑制剂Nutlin-3处理KCs,再建立KCs非耐受模型:(1)、利用ELISA检测细胞上清中TNF-α和IL-10的含量;(2)、WB检测NF-κB p65和Foxo3a蛋白表达和磷酸化水平;(3)、利用全自动细胞计数仪检测KCs生存率。PI3Kγ激动剂IGF-1和预处理小鼠,然后利用MDM2抑制剂预处理小鼠Nutlin-3,再建立小鼠内毒素非耐受模型:(1)、观察和记录生存时间;(2)、HE染色法结合Suzuki评分表评估肝脏组织炎症反应程度;(3)、分离肝脏的KCs后,利用RT-PCR法检测TNF-α和IL-10的mRNA表达水平,以及利用WB检测NF-κB p65和Foxo3a蛋白表达和磷酸化水平。结果:1.与内毒素非耐受模型相比较,KCs内毒素耐受模型中NF-κB通路的活性、Foxo3a磷酸化水平和TNF-α的分泌显著下降,而Foxo3a蛋白表达水平与IL-10的分泌显著提高;过表达Foxo3a可抑制KCs非内毒素耐受模型中NF-κB通路的活性和TNF-α的分泌,提高IL-10的分泌,提高KCs对内毒素的耐受能力;沉默Foxo3a后可提高KCs内毒素耐受模型中NF-κB通路的活性和TNF-α的分泌,抑制IL-10的分泌,降低KCs对内毒素的耐受能力。2.PI3Kγ抑制剂通过抑制AKT的活性,降低KCs中Foxo3a的磷酸化水平,提高Foxo3a的蛋白表达,从而抑制KCs非内毒素耐受模型中NF-κB通路的活性和TNF-α的分泌,提高IL-10的分泌,提高KCs和小鼠对内毒素的耐受能力;PI3Kγ激动剂通过促进AKT的活化,提高KCs中Foxo3a的磷酸化水,降低Foxo3a的蛋白表达,从而抑制KCs内毒素耐受模型中NF-κB通路的活性和TNF-α的分泌,抑制IL-10的分泌,降低KCs和小鼠对内毒素的耐受能力;PI3Kγ激动剂可逆转过表达Foxo3a后抑制KCs内毒素非耐受模型中NF-κB的激活的效果,降低KCs和小鼠对内毒素的耐受能力。3.Foxo3a-p53/MDM2形成负反馈弧,可维持KCs中Foxo3a的蛋白稳定表达。沉默MDM2表达或者抑制MDM2功能后可通过增加Foxo3a蛋白积累,提高KCs和小鼠对内毒素的耐受能力。MDM2抑制剂可逆转由PI3Kγ激动剂介导体内外KCs内毒素耐受模型中NF-κB激活的效果,提高KCs和小鼠对内毒素的耐受能力。结论:1.Foxo3a在核内的蛋白累积可抑制NF-κB的活性,降低炎症因子的分泌,提高KCs和小鼠对内毒素耐受的能力。2.抑制PI3Kγ/AKT磷酸化Foxo3a的作用或者阻断p53/MDM2泛素化降解Foxo3a,均可提高KCs和小鼠对内毒素的耐受能力。3.Foxo3a-p53/MDM2形成的负反馈弧是维持KCs中Foxo3a蛋白稳定的主要机制,也是制约PI3Kγ/AKT诱导Kupffer细胞内毒素耐受的主要平衡机制。