【摘 要】
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目的:肿瘤微环境代谢重编程是膀胱癌的特征之一,特别是糖代谢重编程在膀胱肿瘤发生、发展中发挥了关键作用。而低糖是肿瘤微环境的重要表征,但其对PD-L1的表达及其介导的肿瘤细胞的免疫逃逸机制的影响尚未完全阐明。所以本研究旨在通过构建膀胱肿瘤细胞和CD8+T细胞共培养体系,以此为基础模仿肿瘤低糖微环境,探索糖代谢与PD-1/PD-L1介导的免疫逃逸途径的相关性,并探讨其可能的分子机制。实验方法:首先,通
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目（编号：81472411）；
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目的:肿瘤微环境代谢重编程是膀胱癌的特征之一,特别是糖代谢重编程在膀胱肿瘤发生、发展中发挥了关键作用。而低糖是肿瘤微环境的重要表征,但其对PD-L1的表达及其介导的肿瘤细胞的免疫逃逸机制的影响尚未完全阐明。所以本研究旨在通过构建膀胱肿瘤细胞和CD8+T细胞共培养体系,以此为基础模仿肿瘤低糖微环境,探索糖代谢与PD-1/PD-L1介导的免疫逃逸途径的相关性,并探讨其可能的分子机制。实验方法:首先,通过梯度密度离心法和磁珠分选法从人新鲜外周血中提取CD8+T细胞,并通过流式分选鉴定细胞纯度,以此为基础构建T24膀胱癌细胞与CD8+T细胞的直接共培养体系。分别设置T24单培养组、T24-CD8+T共培养组和CD8+T单培养组,并以正常葡萄糖含量的培养基（2000mg/L）为对照,设置低糖培养（500mg/L）组。并进行了以下检测:1.通过乳酸试剂盒测定细胞上清中的乳酸浓度,以此表征糖酵解水平的变化;2.活细胞工作站检测对照组和低糖组中T24细胞的增殖能力,确定低糖培养对肿瘤细胞增殖能力的影响;3.Western Blot（WB）和qPCR分别检测不同时间点的T24单培养组、T24-CD8+T共培养组和CD8+T单培养组中低糖导致的PD-L1和PD-1的表达变化;以及共培养48h后,各组的EGFR/Erk/c-Jun通路中的蛋白表达情况;4.最后通过ELISA试剂盒测定共培养组和CD8+T单培养组中T细胞分泌的肿瘤杀伤相关因子IFN-γ、GZMB的水平,确定低糖对于T细胞杀伤能力的影响。实验结果:1.成功从人外周血提取了 CD8+T细胞,并通过流式细胞术进行了鉴定。与同型对照相比,我们提取的细胞中CD8+细胞量高达99%,证明细胞纯度良好。2.活细胞工作站摄取的图片及数据分析发现T24单培养组和共培养组中低糖均会抑制肿瘤细胞的增殖能力,同时CD8+T细胞也会抑制肿瘤细胞的增殖。低糖培养会导致肿瘤细胞产生的乳酸量显著减少,而CD8+T细胞的乳酸产生水平则不受影响,说明低糖主要影响肿瘤细胞的糖酵解水平。3.基于PD-L1蛋白主要由T24表达而PD-1蛋白主要由CD8+T细胞表达,共培养条件下,WB结果发现随着时间的推移对照组和低糖组的PD-L1蛋白表达呈上升趋势,免疫逃逸水平不断升高。说明共培养情况下虽然抑制了肿瘤的增殖,但是显著激活了 PD-L1/PD-1介导的免疫逃逸机制,且低糖微环境下24h内亦未影响这种激活,只有在48h时持续消耗后糖浓度极度降低时,与正常共培养组相比PD-L1的表达稍有所下降,但整体依旧处于高逃逸激活状态。此外,培养48h时WB结果分析具体调控机制,发现T24单培养组中低糖可以一定程度激活EGFR/ERK/c-Jun途径同时上调PD-L1表达;而与CD8+T共培养48h时,正常与低糖组的PD-L1水平均升高而EGFR/ERK/c-Jun被显著抑制,低糖组PD-L1和EGFR/ERK/c-Jun途径虽低于正常共培养组,但其PD-L1表达水平仍远远高于T24低糖单培养组。以上结果表明,在T细胞诱导的情况下,会显著抑制肿瘤生长相关通路,但即便处于低糖微环境时依旧可以高激活PD-L1/PD-1介导的免疫逃逸机制。4.通过检测CD8+T细胞杀伤性细胞因子的分泌水平,发现单培养的低糖组和对照组中IFN-γ水平没有显著变化,而GZMB在低糖组的分泌减少,说明低糖会一定程度抑制单纯的CD8+T细胞的杀伤性功能。共培养24小时后,发现低糖组比对照组分泌的IFN-γ和GZMB有轻微的上升,但48h时,IFN-γ和GZMB的分泌水平均被抑制到极低的水平,两组之间无显著差异。说明随着培养时间的延长CD8+T细胞杀伤性功能逐渐减弱,这可能与共培养后PD-L1的高表达导致的免疫逃逸途径的激活相关。结论:本文针对共培养条件下,低糖对于PD-L1/PD-1免疫逃逸机制的影响展开研究。我们发现共培养时PD-L1主要由T24表达而PD-1主要由CD8+T细胞表达,CD8+T细胞是抑制癌细胞增殖并增强免疫逃逸的主要诱导因素,而膀胱肿瘤细胞在低糖微环境下仍可保持PD-L1/PD-1介导的免疫逃逸途径的高激活状态;同时共培养会显著抑制CD8+T细胞的杀伤功能,这可能是由于PD-1识别PD-L1后激活了下游抑制途径。本研究初步阐明:免疫诱导下的肿瘤细胞,即便处于低糖的微环境、增殖能力被大大抑制的情况下,仍然能够显著激活PD-L1表达,抑制免疫细胞功能,从而介导肿瘤的免疫逃逸。
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