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目的: 研究不同浓度的二氯甲烷作用于人正常肝细胞L02不同时间长度,导致氧化损伤及LINE-1基因甲基化改变。
方法: 0-240mM二氯甲烷染毒1-4h,CCK8(改良MTT)法检测活细胞相对数和相对活力;用黄嘌呤氧化酶法测定细胞内SOD活力,通过还原型谷胱甘肽(GSH)的消耗量来测定GSH-Px的活力;MDA和硫代巴比妥酸(thiobarbiturieacid,TBA)反应产生红色产物的显色反应,通过比色法对MDA进行定量检测;8-OHdG通过Elisa试剂盒检测;细胞中DNA经过提取和纯化后,采用焦磷酸测序法检测LINE-1基因甲基化的改变。
结果:
细胞毒性检测:0-240mM的DCM染毒1-4h,(染毒浓度分别为40mM、80mM、120mM、160mM、200mM、240mM,染毒时间为1h、2h、3h、4h)相同染毒时间的条件下,随着浓度的增加细胞的相对存活率降低;染毒浓度固定的条件下,随着时间的延长,细胞的相对存活率降低,存在剂量反应关系和时间效应关系。染毒1-4h的LC50分别为131.9mM、87.8mM、92.5mM和58.2mM。
氧化还原状态检测:DCM染毒1h时,80mM、120mM染毒组与对照组相比细胞内SOD活力显著升高(P<0.05)、8-OHdG浓度显著增加(P<0.05或P<0.01)、GSH-Px活力显著下降(P<0.01),120mM染毒组的MDA显著升高(P<0.05)。染毒3h时,与对照组相比80mM和120mM染毒组的SOD值也显著升高(P<0.05或P<0.01)、MDA值显著升高(P<0.01)、8-OHdG浓度显著增加(P<0.05)。40mM、80mM、120mM染毒组的GSH-PX活力显著下降(P<0.05或P<0.01)。
DNA甲基化检测:DCM染毒3h,三个染毒剂量组和阴性对照组中LINE-1基因甲基化变化无明显差异。
结论 DCM对人正常肝细胞L02具有毒性作用,随浓度升高细胞存活率下降;可以引起细胞的氧化损伤,导致SOD、MDA、GSH-Px、8-OHdG等指标的异常改变。提示DCM对人体健康产生危害的机制可能是通过氧化损伤介导的。本实验条件下,LINE-1基因甲基化情况未发生改变,DCM与表观遗传学改变的关系有待于进一步的研究。