【摘 要】
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多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFAs）是一类含多个不饱和键的长链脂肪酸的统称,可依据多不饱和键个数及位置分为n-3 PUFAs和n-6 PUFAs等类别。它具有促进哺乳动物神经发育和胎儿生长,防治心血管疾病的发生等功能。多不饱和脂肪酸（PUFAs）是人体必需脂肪酸,必须从食物中摄取。由于猪肉是我国居民最主要的肉类消费品,提高其中PUFAs含量,对提高人
【基金项目】
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广东省科技计划项目（2011A020901001）；
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多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFAs）是一类含多个不饱和键的长链脂肪酸的统称,可依据多不饱和键个数及位置分为n-3 PUFAs和n-6 PUFAs等类别。它具有促进哺乳动物神经发育和胎儿生长,防治心血管疾病的发生等功能。多不饱和脂肪酸（PUFAs）是人体必需脂肪酸,必须从食物中摄取。由于猪肉是我国居民最主要的肉类消费品,提高其中PUFAs含量,对提高人们健康水平具有重要意义。为解决猪肉中n-3和n-6 PUFAs含量不足的问题,本研究获得控制PUFAs合成的两个必需酶基因,Δ12脂肪酸去饱和酶基因（fat2）和Δ15脂肪酸去饱和酶基因（fat1）,通过转基因技术初步制备fat1-fat2基因融合表达的转基因猪,并制备fat2-2A-fat1基因共表达的转基因小鼠模型。通过检测发现这两个动物模型肌肉、脂肪等组织中n-3和n-6PUFAs含量都得到了提高,为生产自身合成多不饱和脂肪酸的转基因动物研究提供基础研究。1.融合表达fat1-fat2转基因猪制备及检测我们使用本实验室前期已构建的p CAG-fat1-fat2融合表达质粒,通过脂质体介导稳定转染至猪胎儿成纤维细胞,利用体细胞核移植技术,获得fat1和fat2基因融合表达的转基因猪。本研究共获得5头在3日龄及120日龄均稳定表达fat1-fat2融合基因的转基因猪,利用实时荧光定量PCR证实fat1-fat2融合基因在肌肉组织中高效表达。转基因猪肌肉、皮肤、脂肪组织中PUFAs含量得到提高,其中3日龄转基因猪肌肉组织中n-3 PUFAs总量增加90.34%,n-6 PUFAs总量增加32.64%;120日龄转基因猪肌肉、脂肪、皮肤组织中n-3 PUFAs总量分别增加41.84%（p<0.01）、25.23%（p<0.01）、22.90%（p=0.05）,n-6 PUFAs总量分别降低25.01%（p<0.05）、24.32%（p<0.01）、36.17%（p=0.01）。同时我们发现转基因猪体内组织中SREBP1c、FAS、NFκB基因表达下调;三种组织中PPARα、ELOVL2、ELOVL5基因的表达上调。LXRα基因在三种组织中的表达并未检测到明显变化。2.fat2和fat1共表达质粒的构建及在细胞中的表达和功能验证为进一步提高fat1和fat2基因表达效率,采用重叠延伸PCR技术,利用2A序列构建了实现双基因自我剪切、共表达的fat2-2A-fat1片段;并构建p CAG-fat2-2A-fat1-EGFP共表达质粒。将共表达质粒以脂质体介导瞬时转染至PK15细胞48小时后,细胞能高效表达fa2-2A-fat1;细胞内n-3 PUFAs总量增加30.7%（P=0.05）,n-6 PUFAs总量减少34.74%。3.共表达fat2和fat1的转基因小鼠制备与检测将试验2中构建的共表达双基因质粒经显微注射制备转基因小鼠,最终获得6只F0代阳性小鼠。其中606号小鼠经PCR、Southern blot、m RNA表达量检测和肌肉组织PUFAs含量的检测显示其fat2-2A-fat1基因表达量最高;以此为父本,共繁育出11只F1代阳性小鼠,26只F2代阳性小鼠。通过检测PUFAs含量发现,F0代转基因小鼠肌肉组织中n-6 PUFAs含量较对照组增加30.61%（p<0.01）,n-3 PUFAs总量增加6.87%;脂肪组织中n-6 PUFAs含量降低29.47%（p<0.01）,n-3 PUFAs总量降低29.20%（p<0.01）;皮肤组织中n-6 PUFAs总量升高8.39%,n-3 PUFAs总量下降33.10%。F1代雄性转基因小鼠肌肉组织中n-6PUFAs总量比对照组增加4.31%,n-3 PUFAs总量增加9.47%;雌性小鼠中n-3 PUFAs总量增加16.34%,n-6 PUFAs总量增加22.64%。脂肪组织中雄性小鼠n-3 PUFAs总量增加7.21%,n-6 PUFAs总量增加6.50%;雌性小鼠n-6 PUFAs总量增加16.50%,n-3PUFAs总量减少5.93%。推测转基因小鼠fat2和fat1基因共表达水平及PUFAs含量存在组织和性别上的差异转基因小鼠体内FAS、SREBP1c和LXRα基因在部分组织中表达下调;PPARα、ELOVL2、ELOVL5基因在三种组织中均表达上调;但NFκB基因在三种组织中表达量无显著变化。结论:本研究成功制备fat1和fat2双基因融合表达的转基因猪与共表达转基因小鼠,两种转基因动物体内均能高效表达fat1和fat2基因,显著提高体内PUFAs的含量,为未来培育富含多不饱和脂肪酸的转基因家畜新品种提供基础。
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