由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,MHP)和胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)单独感染或混合感染是引起目前呼吸道综合症的主要原因之一,给养猪业造成严重的危害。猪传染性胸膜肺炎弱毒疫苗是一种新型疫苗,优于传统的灭活疫苗,它可以激发良好的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫,具有良好的抗体反应和不同血清型菌感染的交叉保护,而且使用方便、成本低,是当前国内外研究的热点。针对临床中这两种病原同时感染或继发感染的现状,而分别接种单独的疫苗会造成猪只的应激和养殖成本增加,以致弱的胸膜肺炎放线杆菌表达MHP主要抗原蛋白的突变株,并研制有效的基因工程疫苗,是预防这两种呼吸道传染病的策略。本研究以APP血清10型菌株和猪肺炎支原体为材料,分别克隆APP毒素apxⅠ操纵子的调节基因apx IC以及MHP主要免疫原性蛋白——乳酸脱氢酶(P36)基因,将P36基因插入到apx IC,构建含抗生素标记和负向筛选标记的中间转移载体pEICALDH。将pEICALDH热激法转化大肠杆菌X7213感受态细胞,将转化的阳性子再与胸膜肺炎10型菌进行接合转移试验,通过同源重组,在DAP缺乏的含NAD的TSA培养基上,利用营养缺陷筛选法和SacB负向筛选法,获得P36基因插入apxIC基因的APP突变株,该突变株不含抗生素抗性基因,用突变株培养上清,浓缩后进行western bolt检测,发现浓缩蛋白能与毒素Ⅰ单抗反应。将该毒株划线接种于含绵羊红细胞和NAD的TSA培养基上,观察24-72个小时,未发现溶血现象,说明该突变株丧失了亲本菌株所具有的溶血活性。将10~7CFU/ml的突变株和亲本菌分别接种10只Balb/C小鼠,连续观察14天,亲本菌在接种后24小时内小鼠全部死亡,而突变株接种组小鼠死亡3只,TSB接种组小鼠全部存活,说明突变株对小鼠的毒力下降;用2×10~6CFU/ml重组菌免疫Balb/C小鼠,一个月后用2×10~8CFU/ml亲本菌攻击免疫鼠,保护率为100%,而TSB对照组小鼠全部死亡。这些结果说明,该突变株有望用于疫苗研究。环介导的基因扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型的恒温核酸扩增方法,具有特异、高效、快速的特征。利用水浴锅以及基于apxⅣ基因设计的6个特异性引物,LAMP可以在30分钟内快速检测胸膜肺炎放线杆菌。通过加入SYBR GreenⅠ染料,扩增产物可以肉眼观察。LAMP法检测胸膜肺炎放线杆菌的特异性与Nested PCR相当,但敏感性高于Nested PCR,此方法可以成为快速检测胸膜肺炎放线杆菌的重要手段。