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北极海洋红球菌Rhodococcus sp.B7740（Rh sp.B7740）是我国北极科考队第三次科考期间于北极站点B77处（1464?9.28?W,76?58.08?N）25米深的海水中获得的菌株,经16S r RNA序列分析和形态学观察确定其为红球菌。其外观呈现鲜艳的橙红色,生存环境极为特殊,在此之前尚未见相关次生代谢产物的报道。为了探索和了解这株北极海洋红球菌所产红色色素的特殊结构及功能性,我们采用非常规的分离纯化方法,采用多光谱和LS-MS/MS分析,发现和确证了所产色素为类胡萝卜素及类异戊二烯醌类的混合物（B7CIQE）,有别于其他来源的类胡萝卜素,其中包含特殊结构的芳香类胡萝卜素isorenieratene,chlorobactene和synechoxanthin,它们首次在红球菌中被鉴定,自然界中也十分稀有和新奇。除此而外,价格昂贵且稀有的长链质子化甲基萘醌MK8（H2）以高产量存在（约1mg/g细菌湿重）,也为我们研究有价值的异戊二烯类化合物提供了物质基础。为了证实北极海洋红球菌Rhodococcus sp.B7740中异戊二烯类色素的健康意义,首先对其基本生物活性进行了研究。然后在此基础上,采用本课题研究得到的高速逆流色谱（HSCCC）体系首次同时分离获得了高纯度的芳香类胡萝卜素的3种单体;采用多光谱和生物技术着重研究了食品中存在,但研究极少的isorenieratene（φ,φ-胡萝卜素）的稀有生物活性,并进行了较为系统的评价。课题的研究不仅为探索北极海洋新奇微生物中有益于人类的色素资源宝库展示了新的研究领域,丰富了海洋微生物类胡萝卜素的多样性,同时也为揭示这些罕见的芳香类胡萝卜素的结构和独特生物活性奠定了理论和实验基础。本论文的主要研究结果如下:1. B7CIQE主要组成成分研究采用溶菌酶破壁和表面活性剂增溶,成功地从北极海洋红球菌Rhodococcus sp.B7740中同时提取出了类胡萝卜素和类异戊二烯醌类化合物,经HPLC-DAD-MS/MS联用,初步探究了B7CIQE的主要成分,证实该菌中含有9种类胡萝卜素和14种异戊二烯醌,发现和首次从红球菌鉴定了三种罕见的芳香类胡萝卜素,包括18%all-trans-synechoxanthin（24.18-33.40μg/g）,11%chlrobactene（14.78-19.34μg/g）,9%isorenieratene（12.09-15.82μg/g）,在此之前未见任何相关文献报道,为北极海洋红球菌提供了新的研究方向和领域,也丰富了极地海洋微生物来源类胡萝卜素的多样性和新颖性,同时也获得了新颖芳香类胡萝卜素的新资源,使Rh sp.B7740成为了一种极具潜力的工程菌。2. B7CIQE抗氧化与抗增殖活性研究采用β-胡萝卜素漂白法等方法,在体外和细胞水平研究了Rhodococcus sp.B7740红球菌中类胡萝卜素及类异戊二烯醌类提取物整体的抗氧化及抗人肝癌细胞Hep G2和人口腔癌细胞KB的增殖活性。研究结果表明,β-胡萝卜素氧化抑制率为B7CIQE（70.20%）>2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（66.70%）>表没食子儿茶素没食子酸酯（17.80%）>番茄红素（1.90%）;油脂开始氧化温度的高低顺序为B7CIQE（175℃）>β-胡萝卜素（165℃）>叶黄素（162℃）>番茄红素（160℃）;蛋白质氧化抑制率为B7CIQE（25.75%）>β-胡萝卜素（24.97%）>叶黄素（17.94%）>番茄红素（10.40%）;Hep G2细胞抗增殖实验半最大效应浓度为叶黄素（20.86μg/m L）<β-胡萝卜素（124.88μg/m L）<B7CIQE（126.34μg/m L）<番茄红素（139.24μg/m L）;KB细胞抗增殖实验的半最大效应浓度为B7CIQE（25.14μg/m L）<叶黄素（64.29μg/m L）<番茄红素（69.87μg/m L）<β-胡萝卜素（149.16μg/m L）。实验证明,B7CIQE具有优良的抗氧化活性和抗肝癌细胞和口腔癌细胞增殖作用,为进一步研究其在人体内的活性提供了前期基础。3. B7CIQE中芳香类胡萝卜素的分离纯化与结构鉴定通过实验,我们获得了一种未曾报道的分离纯化B7CIQE的高效HSCCC方法,也可借用于对其它类胡萝卜素的分离。并确定了相关的分析条件,即当溶剂体系为正己烷-乙腈-二氯甲烷同时体积比固定为10:6.75:3.25（v/v/v）时,B7CIQE中多种类胡萝卜素均有较好的分离纯化效果。纯化后收集的isorenieratene和chlorobactene的高效液相色谱纯度达90%以上（isorenieratene纯度约为92.87%,chlrobactene约为96.39%）,证明了该方法的高效性。同时,经过高精度质谱对分离纯化出的三种芳香类胡萝卜素鉴定结果表明,三种芳香类胡萝卜素（synechoxanthin,isorenieratene和chlorobactene）的MS测试值与理论计算值差别均在10ppm以内,进一步证实了这三种类胡萝卜素的分子结构。4. B7CIQE中双芳香环isorenieratene（φ,φ-胡萝卜素）在含铁胃液中的稳定性及与HSA的相互作用双芳香环且结构对称的φ,φ-胡萝卜素最初是在欧洲奶酪中发现,本课题中该色素首次从红球菌中发现和分离,对于其结构和生物活性的研究极为少见。该化合物比植物来源类胡萝卜素拥有更高的稳定性,为了了解在人体消化过程中及对过渡金属离子和低p H稳定性,我们选用较低p H的胃环境,考察其在模拟胃环境下的稳定性和保存量。研究发现,在铁离子和氧存在下,从B7CIQE中纯化得到的isorenieratene,与β-胡萝卜素和叶黄素相比,具有显著的高稳定性（存留率均在95%以上）,可抵抗低p H环境下不同形式铁的催化和氧的攻击。同时,本章采用多光谱和模拟对接研究了isorenieratene与HSA的相互作用。结果表明,与高等植物来源的膳食类胡萝卜素（β-胡萝卜素和叶黄素）相似,isorenieratene能与HSA发生静态结合作用,抑制了人血清白蛋白的荧光光谱。isorenieratene与HSA的绑定常量（Ksv和Ka）均在适宜范围内,与非芳香族类胡萝卜素略有差异,其值略高。这说明isorenieratene在血液循环的储存和分布中具有良好的状态。实验结果表明,Isorenieratene与HSA结合绑定的过程是自发放热,与β-胡萝卜素-HSA和叶黄素-HAS体系一致,isorenieratene-HSA的相互作用在体系中的作用力主要以疏水性作用和静电引力为主。电脑模拟对接实验表明,isorenieratene可能同时附着于HAS的位点I和位点II,但位点II可能是主要结合位点,这与荧光竞争实验研究结果一致。同步荧光光谱学研究表明,isorenieratene-HSA的相互作用增强了HSA中Trp和Tyr微环境的极性。红外光谱检查结果显示,与HSA相比,isorenieratene-HAS体系中的α-helix结构呈下降趋势,β-turn增加,表明蛋白部分结构展开。表面增强拉曼光谱结果显示,与游离HSA体系相比,isorenieratene-HSA的相互作用减少了蛋白的α-helix结构,同时isorenieratene-HSA体系中Phe微环境具有更强的疏水性。此外,表面增强拉曼光谱图谱中,isorenieratene-HAS体系的类胡萝卜素标记峰比非芳香类胡萝卜素相比更强,表明isorenieratene在结合过程中具有更高的稳定性。这与它的多不饱和高度对称性有关,双芳香环和对称的异戊二烯结构,使电子在大π键上呈离域均匀分布,从而提高其稳定性。5. Isorenieratene对紫外诱导视网膜伤害的抑制作用及其机制研究利用多层磷脂囊模型和人视网膜细胞ARPE-19模型分析isorenieratene对UVB诱导的损伤的潜在作用,实验数据表明,isorenieratene与两种视网膜黄斑色素（叶黄素和玉米黄质）相比,具有较好的抗氧化能力和抗UVB辐射作用。电子顺磁共振结果表明,isorenieratene能降低模型脂质体系中单重态氧自由基和羟基自由基的形成。与叶黄素（88.84%Q1-LL）和玉米黄质（77.67%Q1-LL）相比,MTT和流式细胞检测结果证明了isorenieratene对UVB照射模型中ARPE-19（75.36%Q1-LL）具有更好的保护作用（90.94%Q1-LL）。经过ROS、RT-PCR和WB分析测试解释了isorenieratene保护ARPE19降低紫外损伤作用的分子机制,主要包括两方面,其一是在细胞内的优良抗氧化作用,其二为isorenieratene上调细胞内tspo基因表达和与TSPO蛋白的含量。此外,分子对接也同样证实了isorenieratene能与TSPO蛋白发生良好的结合作用（S=-8.5438）。因此,我们认为isorenieratene作为一种芳香类胡萝卜素可能具有多种活性功能,包括保护视网膜和抑制紫外线诱导损伤等。