研究背景：葛根芩连汤为医圣张仲景的名方,有解表清理、升清止痢的功效。临床上用于治疗外感表证未解、热邪入里之证。对泄泻、痢疾属里热者,均可应用,是表里双解的代表方。该方由葛根、黄芩、黄连、炙甘草4味中药组成,当中含有多个常用药对及常见配伍。因此,选用该方进行配伍研究极具代表性。本实验室在国家和省级自然基金的资助下,对该方进行了配伍规律、组方、物质基础、质量控制、药理、毒理、药代动力学等方面的研究。综合研究证实,该方配伍具有降低黄连对机体不利因素和增强综合疗效的作用,但具体的增效减毒机制还有待进一步研究。许多方剂配伍在煎煮过程中都有沉淀物产生,而研究表明,汤药沉淀物中含有药材的主要药效成分,具有一定的药理作用。但关于沉淀物在体内环境影响下的变化研究鲜有报道。越来越多的研究证明,中药中的一些成分,如某些黄酮类、香豆素类、生物碱类是肠道外排蛋白P-糖蛋白(P-gp)的底物。因此,中药中成分之间可能会发生药物间的相互作用,从而影响其吸收和疗效。通过研究方药代表性化学成分在肠道中的吸收规律和相互作用关系,可为阐述中药复方配伍机理提供新的切入点。研究目的：中药复方配伍是中医用药的一大特色和优势,了解配伍规律对临床辨证施治有重要的指导意义。中药复方多以口服形式入药,药物在肠道部位的吸收是影响药物生物利用度和疗效的关键因素。为研究葛根芩连汤的配伍规律和组方原理,采用模拟人体胃肠道环境的方法对葛根芩连汤沉淀物的溶出度进行研究,为进一步开展葛根芩连汤沉淀物体内药动学和药效学研究打下基础；采用大鼠在体肠回流实验方法研究盐酸小檗碱及葛根素配伍的肠吸收变化情况,为阐明该方配伍后增效减毒的机理研究提供新的思路。1、对有关葛根芩连汤方药的研究文献进行分类综述,根据该方药味的配伍特点和目前国内外中药对肠道P-gp调控的研究概况,结合实验室前期对配伍规律、组方、物质基础、质量控制、药理、毒理、药代动力学等方面的研究结果,对葛根芩连汤配伍增效减毒的机理加以合理分析。2、对葛根芩连汤煎煮过程产生沉淀物在胃肠环境的溶出度进行研究,考察沉淀物经口服后在胃肠道是否能重新溶解出来而被吸收。为下一步的沉淀物体内药动学和药理学研究打下基础。3、考察黄连提取物中盐酸小檗碱和盐酸药根碱在肠道部位的吸收特征,为进一步研究葛根素对盐酸小檗碱肠吸收影响肠段的选择提供依据。同时也可结合现有对葛根黄酮、黄芩黄酮在肠道部位吸收特征的研究结果,为葛根芩连汤的剂型开发提供参考。4、研究盐酸小檗碱和葛根素配伍肠吸收变化,从肠吸收角度初步分析葛根芩连汤配伍后盐酸小檗碱和葛根素体内血药浓度变化的原因,为配伍的增效减毒机理提供佐证。研究方法：1、以计算机检索、手工追溯检索等手段相结合,充分利用CA、BP、CNKI数字图书馆全文数据库、中文生物医学期刊文献数据库、互联网等工具书、数据库,广泛查阅有关葛根芩连汤方药研究、中药沉淀物研究和中药对肠道P-gp调控影响的研究资料,结合本实验室对该方的研究结果进行综合分析。2、采用高效液相色谱法测定葛根芩连汤上清液、沉淀物和煎液中药材的主要药理效应成分葛根异黄酮类、黄连生物碱类、黄芩黄酮类和甘草中甘草苷、甘草酸的含量；采用模拟人体胃肠环境的方法对沉淀物中上述成分在人工胃液和人工肠液中的溶出度进行研究。3、采用大鼠在体肠回流实验法,从不同肠段和不同药物浓度两方面考察盐酸小檗碱和盐酸药根碱的肠吸收特征,肠循环液中盐酸小檗碱和盐酸药根碱分析方法采用高效液相色谱法。色谱条件如下：Kromasil C18色谱柱(150mm×4.6 mm,5μm)；流动相：乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾溶液(37：63)；柱温：35℃；流速：1.0mL/min;检测波长：265nm；进样量：20μL。4、采用大鼠在体肠回流实验方法,研究盐酸小檗碱和葛根素配伍过程中的肠吸收变化。肠循环液中盐酸小檗碱和葛根素分析方法采用高效液相色谱法,具体色谱条件如下：(1)盐酸小檗碱色谱条件：Kromasil C18色谱柱(150mm×4.6 mm,5μm)；流动相：乙腈-0.033mol/L磷酸二氢钾溶液(37：63)；柱温：35℃；流速：1.0mL/min;检测波长：265nm；进样量：20μl。(2)葛根素色谱条件：KromasilC18色谱柱(150mm×4.6 mm,5μm)；流动相：甲醇-水(25：75)；柱温：25℃；流速：1.0mL/min;检测波长：250nm；进样量：10mL。实验结果：1、利用各种检索工具、数据库,查阅文献近百篇；通过综述上述文献,葛根芩连汤沉淀物的产生可能是该方发挥综合疗效的因素之一。目前尚未发现有通过葛根芩连汤沉淀物的基础研究及从肠吸收角度的研究来揭示葛根芩连汤配伍规律的报道。2、葛根芩连汤沉淀物主要效应成分在胃肠液中的溶出度2.1煎液、沉淀物和上清液样品各类成分的含量测定结果①葛根异黄酮类：煎液的含量跟上清液与沉淀的和相当。沉淀物葛根素和大豆苷的含量明显小于在上清液中的含量,但沉淀物中大豆苷元含量明显大于上清液。②黄连生物碱类：沉淀物中盐酸小檗碱、盐酸巴马汀的含量与上清液的含量相当,但沉淀物中药根碱的含量明显大于上清液。③黄芩黄酮类：沉淀中黄酮类成分的含量比上清液最高(沉淀中黄芩苷的含量约是上清液的1.5倍,黄芩素和汉黄芩素的量约是上清液的2倍),沉淀物和上清液中黄芩黄酮类的总量与煎液中相当。④甘草酸和甘草苷：上清液中甘草酸和甘草苷的含量均大于沉淀物中的含量,沉淀物和上清液中甘草酸、甘草苷的总量与煎液中相当。2.2沉淀物中各类成分溶出度测定结果①葛根异黄酮类：与在水中的溶出度相比,沉淀物中葛根黄酮类成分在人工胃液和肠液中的溶出量均有不同程度的增加,其中胃液对沉淀物中葛根黄酮类成分的溶出具有明显的优势。而经人工胃肠液共同作用后,葛根黄酮类成分的溶出率均显著提高,且溶出率随在人工胃肠液中溶出时间的延长而增加。②黄连生物碱类：与在水中的溶出度相比,沉淀物中各生物碱类在人工胃液中的溶出量均明显增加,在人工肠液中的溶出率也有不同程度的增加,而经人工胃肠液共同作用后,生物碱类成分的溶出率均显著提高,且溶出率随在人工胃肠液中溶出时间的延长而增加。③黄芩黄酮类：与在水中和人工肠液中的溶出度相比,沉淀物中黄芩黄酮类在人工胃液的溶出率有明显的提高,而在水中和人工肠液中沉淀物黄芩黄酮类的溶出差异不大,但经人工胃液肠液共同作用后,其溶出率明显增加。溶出率随在人工胃肠液中放置的时间增加而增加。④甘草酸和甘草苷：与在水中和人工肠液中的溶出率相比,沉淀物中甘草苷和甘草酸在人工胃液的溶出率差异显著大,而人工肠液中沉淀物甘草苷和甘草酸的溶出率也比水大。沉淀物中甘草酸在水和胃肠液中的溶出率均比甘草苷大。经人工胃液肠液共同作用后,甘草酸和甘草苷的溶出率明显增加。溶出率均随在人工胃肠液中放置的时间延长而增加。3、盐酸小檗碱和盐酸药根碱的肠道吸收特征3.1盐酸小檗碱、盐酸药根碱在体大鼠不同肠段吸收特征的研究盐酸小檗碱在十二指肠段的吸收百分率(Pa)和吸收速率常数(Ka)均高于其他肠段且差异具有统计学意义(P<0.01)。盐酸小檗碱在不同肠段的Pa和Ka均按十二指肠>空肠>回肠>结肠顺序依次下降。与十二指肠相比,盐酸药根碱在空肠、回肠和结肠的Pa和Ka均降低且具有显著性差异(P<0.01或P<0.05)。盐酸药根碱在结肠部位的吸收最少；盐酸药根碱在不同肠段的Pa和Ka也均按十二指肠>空肠>回肠>结肠顺序依次下降。3.2不同浓度黄连提取物盐酸小檗碱、盐酸药根碱大鼠在体肠吸收情况盐酸小檗碱、盐酸药根碱在肠道的Pa均随着浓度提高而增加,且当黄连提取物在22-88 mg·L-1浓度范围内未出现饱和吸收现象,与22μg/mL组比较,其它两组的Pa均具有显著性差异(P<0.01)；提取物浓度在22-88 mg·L-1范围内盐酸小檗碱、盐酸药根碱的Ka均没有显著性差异(P>0.05)；以上两项指标表明盐酸小檗碱和盐酸药根碱的吸收机制为被动扩散。4、盐酸小檗碱和葛根素配伍过程的肠吸收变化研究4.1葛根素对盐酸小檗碱大鼠在体肠吸收的影响,药物配伍组别分别为黄连提取物44μg/mL(记为A)组,黄连提取物44μg/mL+葛根素22μg/mL(记为B)组,黄连提取物44μg/mL+葛根素44μg/mL组(记为C)组,黄连提取物44μg/mL+葛根素88μg/mL(记为D)组和黄连提取物44μg/mL+环孢素120μg/mL(记为E)阳性对照组。实验结果表明,与A组相比,B、C、D三个组的盐酸小檗碱在肠道吸收的百分率不具有显著性差异(P>0.05),而和E组相比,A、B、C、D四个组的盐酸小檗碱在肠道吸收的百分率具的差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01); A、B、C、D、E五个组别的Ka没有显著性差异(P>0.05)。4.2盐酸小檗碱对葛根素大鼠在体肠吸收的影响,药物配伍组别分别为：葛根素50μg/mL(记为A)组,盐酸小檗碱15μg/mL+葛根素样品50μg/mL(记为B)组,盐酸小檗碱30μg/mL+葛根素样品50μg/mL(记为C)组,盐酸小檗碱60μg/mL+葛根素样品50μg/mL(记为D)组和葛根素样品50μg/mL+环孢素120μg/mL(记为E)阳性对照组。实验结果表明,与A组比较,B组的葛根素肠道Pa和Ka差异均不具统计学意义(P>0.05),而C、D、E三组的葛根素肠道Pa和Ka与A组相比均具有显著性差异(P<0.01)；与E组比较,B、C、D三个组的葛根素Pa差别也具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),而C、D两组的Ka与E组比较差别不具有统计学意义(P>0.05)。研究结论：1、葛根芩连汤沉淀物中含有多种活性成分,人工胃、肠液环境对沉淀物中各类成分的溶出度有一定的影响,溶出度有一定的增加,并随时间的延长,溶出量逐渐增加。该研究表明,葛根芩连汤在煎煮过程中产生沉淀物中的药理效应成分可在人工胃肠道中重新释放出来,经体内吸收,为沉淀物进一步的体内药动学和药效学研究做好铺垫。研究提示,组方配伍产生沉淀可能是配伍的科学内涵之一。2、在一定浓度范围内盐酸小檗碱(Ber)和盐酸药根碱(Jat)的Ka差别不大；Ber和Jat在整个小肠都有一定程度的吸收,吸收窗较长,与其它部位相比,Ber和Jat在十二指肠部位的吸收具有明显的优势、在结肠的吸收最差；Ber和Jat在肠道的吸收呈一级动力学过程,吸收机制为被动扩散。3、三组不同浓度葛根素对盐酸小檗碱在肠道部位的Pa和Ka影响不大(P>0.05)；盐酸小檗碱在低浓度(15μg/mL)时对葛根素的吸收影响不大,随着浓度的提高,可逐步提高葛根素的吸收程度和速度,促进葛根素的吸收,但促吸收的效果没有P-gp抑制剂环孢素明显。