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骨缺损在临床上十分普遍,而由多种原因造成的极限骨缺损仍是正颌外科、口腔颌面外科以及口腔种植科医生所面临的严峻挑战之一。骨形态发生蛋白(BMPs)是一组具有诱导异位成骨能力的二聚体蛋白,属于转移生长因子-p超家族成员,是促进骨再生研究领域的主要细胞因子之一。在极限骨缺损修复中,BMPs的介入治疗由于其具有相对便利的可操作性有望替代骨移植治疗。第一部分骨形态发生蛋白异源二聚体诱导成骨发生的体外比较研究目的：BMP同源二聚体(如BMP2、BMP7)由于其过高的有效使用剂量而未能在临床普遍应用。BMP异源二聚体近年来被报道具有比相应同源二聚体更强的诱导骨形成作用。然而,BMP异源二聚体在一系列成骨发生细胞事件,如细胞趋化迁移、细胞增殖、成骨分化以及细胞基质外矿化等环节中的具体生物学作用尚不明确。本实验旨在采用纯化的rhBMP2/7异源二聚体以及相应的同源二聚体分别作用于成骨前体细胞,以此比较研究BMP异源二聚体在体外诱导成骨发生的具体生物学功能特点。材料和方法：通过时间梯度和浓度梯度系统性研究rhBMP2/7、rhBMP2、rhBMP7以及rhBMP2和rhBMP7的等比混合在诱导成骨前体细胞MC3T3-E1成骨发生过程中的作用,检测成骨发生各阶段的相关指标：用实时定量细胞电感应／细胞迁移系统(RT-CES/CIM system)监测细胞趋化迁移运动；用荧光定量法检测细胞增殖后DNA含量；用比色法检测细胞成骨分化碱性磷酸酶(ALP)活性；用ELISA方法检测成骨细胞骨钙素(OCN)的分泌量；用实时荧光定量RT-PCR检测细胞成骨相关基因(ALP、OCN、Col1、Runx2)的表达水平；用茜素红染色观察并计量细胞矿化培养后的基质外矿化结节面积。结果：RhBMP2/7异源二聚体在诱导成骨发生的各阶段均呈现与rhBMP同源二聚体相似的作用模式。RhBMP2/7诱导MC3T3-E1趋化迁移、细胞增殖和细胞成骨分化的起效浓度和最佳浓度是rhBMP同源二聚体的1／10～1／2,但其最大作用效果除了诱导细胞趋化迁移显著高于同源二聚体外,其余几项指标,包括ALP活性、OCN表达量均与rhBMP2的最大作用效果相近。此外,在较低浓度范围内(5-100ng/ml), rhBMP2/7异源二聚体在细胞成骨发生的早期阶段(第1-4天)相比与rhBMP同源二聚体的作用优势要显著强于细胞成骨发生的后阶段(第4～7天)。与以往的研究结果相似,rhBMP同源二聚体的等比混合并不能带来协同效果。茜素红钙化结节染色面积的比较突出表明了rhBMP2/7 (50ng/ml)在3周时即能有效促进细胞外基质矿化；而rhBMP同源二聚体组(50ng/ml)以及对照组均只有在4周时才能观察到矿化结节,并且,rhBMP2/7诱导的矿化面积是rhBMP2组的12倍,rhBMP7组的38倍。不管是rhBMP2/7还是rhBMP同源二聚体,在诱导细胞趋化迁移、增殖、ALP活性以及成骨相关基因表达上都呈现浓度-效应钟形曲线,即并非浓度越高,作用效果越好,提示了rhBMPs必须以适宜的浓度作用于细胞才能发挥其诱导细胞成骨发生各环节的最佳作用效果。结论：RhBMP2/7异源二聚体在诱导细胞成骨发生的有效作用浓度低至5ng/ml,是相应同源二聚体的1／10,并于50ng/ml达到作用峰值平台期,其水平与相应同源二聚体在高浓度时获得的最高作用水平无显著性差异。该特点使得rhBMP2/7有替代rhBMP2应用于临床的潜力,并且符合生理规律的低水平缓慢释放能使rhBMP2/7在诱导成骨发生过程中发挥最佳效果。第二部分骨形态发生蛋白异源二聚体影响破骨发生的体外比较研究目的：BMP同源二聚体能显著刺激破骨细胞的分化和功能,特别是当其以较高的临床使用剂量应用时。BMP异源二聚体由于其具有低浓度起效,有效作用浓度低等特点有望替代BMP2同源二聚体。但现有的文献报道尚未涉及BMP异源二聚体对破骨细胞的作用。BMP异源二聚体是否在破骨发生中也呈现低浓度起效的作用特点值得研究。本实验的目的在于比较研究BMP异源二聚体和相应的同源二聚体在影响细胞破骨发生中的作用。材料与方法：通过时间梯度和浓度梯度系统性研究rhBMP2/7、rhBMP2、rhBMP7以及rhBMP2和rhBMP7的等比混合在影响RANKL (50ng/ml)诱导的破骨前体细胞RAW264.7破骨发生过程中的作用,检测破骨发生各阶段的相关指标：用荧光定量法检测细胞增殖后DNA含量；用比色法检测细胞破骨分化抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性；用实时荧光定量RT-PCR检测细胞成骨相关基因(TRAP基因Acp5、降钙素受体基因Caclcr、蛋白组织酶K基因Ctsk)的表达水平；用TRAP染色观察并计量TRAP+多核细胞(TRAP+MNCs)的表面积、数目以及单位表面积；用破骨细胞活性分析板(OAAS)检测破骨细胞的钙盐吸收功能。结果：经过3d的rhBMPs刺激,RANKL诱导的RAW264.7细胞增殖明显,并出现融合。RhBMP2/7的最有效促进增殖浓度是150ng／ml,rhBMP2、rhBMP7均是lOng/ml, rhBMP2+rhBMP7是100ng/ml,四组之间的最高DNA含量水平基本相近。经过4d的rhBMPs刺激,TRAP活性均被有所上调,并以100-150ng/ml时上调幅度最大。破骨相关基因的表达变化显示rhBMP2在200ng/ml时能有效促进Acp5基因的表达,而rhBMP2/7、rhBMP7无显著上调作用。Calcr的表达水平与RANKL对照组相比反而降低,特别是rhBMP2/7和rhBMP2在5ng/ml时以及rhBMP7在200ng／ml时。RhBMPs的额外加入对Ctsk表达水平的影响与RANKL对照组相比略有升降,但并无显著性差异。TRAP+MNCs最大表面积在150ng/ml的rhBMP2作用下获得,并显著高于150ng／ml的rhBMP2／7以及100ng/ml的rhBMP7.各组诱导的TRAP+MNCs数目的最高值基本相近,相应的TRAP+MNCs单位表面积以rhBMP2(200ng／ml)组最大。经过7d的rhBMPs刺激,所有实验组的破骨细胞在OAAS板上形成的钙盐吸收陷窝面积平均值均显著大于RANKL对照组,除了rhBMP7(150ng／ml)。比较这三组rhBMP的促进破骨细胞钙盐吸收的作用,获得最大吸收面积的组别依次为rhBMP2(150ng/ml), rhBMP2(50ng/ml)和rhBMP2/7 (150ng/ml),以及rhBMP7 (5ng/ml)。RhBMP2和rhBMP7的等比混合在各项指标的检测中并没有产生协同作用。结论：RhBMP2/7、rhBMP2以及rhBMP7都能进一步调控经RANKL诱导的RAW264.7细胞的破骨发生。RhBMP2/7异源二聚体在其中呈现浓度依赖效应递增趋势,并且仅在高浓度时诱导破骨发生的最大作用效果稍低或接近于rhBMP2同源二聚体。以上结果提示,当rhBMP2/7低剂量应用时,仅能最小程度地刺激细胞破骨发生,因此在促进成骨发生的同时并不会带来显著的破骨吸收。总结RhBMP2/7异源二聚体在诱导细胞成骨发生的有效作用浓度低至5ng/ml,并于50ng／ml达到作用峰值平台期；而相应]hBMP2、rhBMP7同源二聚体的起效浓度为50ng／ml；两者在各自适宜浓度时诱导成骨发生的最大作用效果相近。RhBMP2/7异源二聚体在诱导细胞破骨发生的过程中,在5-200ng/ml浓度范围内基本呈现浓度依赖效应递增趋势,在高浓度时诱导破骨发生的最大作用效果稍低或接近于rhBMP2同源二聚体。基于以上两种特点,若将rhBMP2/7以低剂量应用,则能有效促进成骨发生,而同期破骨发生未被刺激或仅被微弱刺激,从而比rhBMP同源二聚体更有利于骨缺损区的新骨形成和种植体周围的骨整合。