忍冬藤注射液制剂的研究

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仔猪白痢是由大肠杆菌引起的10~30日龄以内的仔猪下痢及排出灰白色粥状粪便的常发疾病。中兽医学认为,仔猪白痢是由于仔猪脾胃虚弱和抵抗力低,暑湿热毒乘虚侵入胃肠,引起脾胃腐熟、运化失职,清浊不分,混杂而下,而成拉稀。因此,根据中兽医学理论和临床中药的治疗实践,筛选出的以清热解毒、抗菌消炎、止痢固肠为主,化湿平肝为辅的中药,对防治仔猪白痢病的发生发展具有一定的基础作用。忍冬藤作为忍冬科植物的干燥茎枝,具有清热解毒,疏风通络之功效。在治疗温病发热,疮痈肿毒,热毒血痢,风湿热痹方面有良好疗效。忍冬藤有抗菌消炎、通经活络等药理作用,其中有机酸和环烯醚萜苷均具有明显的生理活性,绿原酸和咖啡酸具有显著的抗菌、抗病毒作用,当药苷具有保肝作用,马钱子苷具有抗炎作用及调节免疫等作用。目前,以忍冬藤经提取制成的药物已广泛应用于人类医学临床,忍冬藤注射液可作为新的具有良好的抗菌消炎效果、治疗家畜炎症性疾病的兽用新制剂。本实验首先对该注射液的质量标准进行初探,利用薄层色谱法鉴别出其中主要成分绿原酸和马钱苷,利用高效液相色谱法对绿原酸进行含量测定,得到绿原酸在0.071.75μg的范围内与峰面积呈良好的线性关系,标准曲线的线性回归方程为:y=2.68692e-007x+2.7590728e-003,r=0.9999(n=6),该注射液中绿原酸含量为0.84mg/ml。通过小鼠急性毒性实验对忍冬藤注射液的安全性进行评价。小鼠腹腔注射忍冬藤注射液,一天2次,每次0.25mL/10g,连续观察14天;结果显示,给药组小鼠未见死亡,小鼠精神状态、食欲、大小便、被毛皮肤、呼吸、眼鼻口等生理变化均未见到异常现象;并且得到腹腔注射忍冬藤注射液小鼠在一天内的最大给药量为0.5mL/10g,即忍冬藤生药含量为0.5g/10g,忍冬藤注射液在此药物浓度范围内不具备毒性,具有良好的安全性。由于在脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应过程中,胞内炎性信号蛋白的活化能够介导炎性细胞因子基因的转录和翻译,从而不断扩大炎性损伤;因此,通过对促炎细胞因子的抑制作用能够在一定程度上达到对炎症的控制。本实验通过脂多糖(LPS)刺激RAW264.7巨噬细胞,建立体外炎症模型,利用ELISA法测定了忍冬藤注射液对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞TNF-α、IL-6和IL-10的分泌水平,结果显示,不同质量浓度的忍冬藤注射液能够极显著抑制促炎细胞因子TNF-α和IL-6的产生和释放,并且呈现出剂量依赖性;同时,不同质量浓度的忍冬藤注射液能够呈剂量依赖性升高LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IL-10的分泌,提示忍冬藤注射液可以通过调节细胞因子的分泌和释放起到一定的抗炎作用。为进一步确定忍冬藤注射液的抗炎作用机制,本实验利用Western-blot试验方法研究了忍冬藤注射液对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞IκB-α蛋白的影响,结果显示,忍冬藤注射液可以极显著抑制IκB-α的磷酸化作用,减轻其降解的程度,提示忍冬藤注射液可能通过调控细胞内信号蛋白分子IκB-α的活性调节炎症介质的分泌水平,起到一定的抗炎作用。综上所述,本实验通过薄层色谱法鉴定出忍冬藤注射液的主要成分绿原酸和马钱苷,并利用高效液相色谱法测定了其主要成分绿原酸的含量;通过小鼠急性毒性试验确定忍冬藤注射液腹腔注射小鼠一天内的最大给药量0.5mL/10g,在此浓度范围内不具备毒性;ELISA和Western-blot实验结果表明,忍冬藤注射液具有一定的体外抗炎作用。
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