第一部分脂氧素A4抑制肝癌细胞的EMT、增殖、迁移、血管新生和转移及促凋亡作用实验背景大量的研究结果表明,慢性炎症与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。而当前肝癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,生长快,转移早,死亡率高。肝癌与慢性肝炎密切相关已经为人们所熟知,所以肿瘤炎症微环境成为当前炎症相关肿瘤研究的热点。而肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）是肿瘤炎症微环境中的重要组成部分,在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色。脂氧素（Lipoxin, LX）被形象地称为炎症过程中的刹车信号,通过跨细胞途径由花生四烯酸合成,是体内最重要的抗炎促消退介质之一。我们课题组的前期研究结果已经证实,脂氧素A₄ （LXA₄）能够抑制小鼠巨噬细胞系RAW264.7和HepG2细胞内的核因子-κB（nuclear factor, NF-κB）的活性,这为我们研究LXA4的抗肝癌作用提供了依据。实验目的体外实验研究LXA4对人肝癌细胞（HepG2） epithelial-mesenchymal transition（EMT）、凋亡、增殖、迁移、血管新生的影响及其机制；体内实验通过构建H22荷瘤小鼠模型,研究LXA4类似物BML-111对原发瘤增殖,血管新生,炎细胞浸润,侵袭及转移的影响及其机制。实验方法采用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）和激活巨噬细胞上清液（activated macrophage-conditioned media, ACM）分别体外模拟炎症微环境模型,分别通过HE染色,免疫荧光,western blotting及RT-PCR检测LXA4对HepG2细胞EMT转变的影响；通过Hoechst染色、免疫荧光和流式细胞检测LXA4对HepG2细胞凋亡的影响；MTT、RT-PCR和western blotting观察LXA4对HepG2细胞增殖的影响及其机制；伤口愈合实验观察LXA4对HepG2细胞迁移的影响；ELISA法检测对HepG2细胞上清液中内皮细胞生长因子（VEGF）的影响；体内实验观察BML-111对H22荷瘤小鼠原发瘤细胞侵袭,血管新生,凋亡,增殖,炎细胞浸润及肿瘤转移的影响及其机制。实验结果1.LXA4能有效抑制LPS诱导HepG2细胞发生EMT转变。HE形态观察,LPS刺激后,细胞排列松散,加入LXA4干预后,细胞恢复上皮细胞的紧密连接。脂氧素受体（FPRL1受体）阻断剂Boc-2能部分阻断这种作用,细胞形态介于LPS组和LPS+ LXA4组之间。同时免疫荧光检测发现,LPS刺激后,上皮性标记E-cadherin明显减弱,P53负性调节E-cadherin,而间叶性标记Vimentin和Fibronectin明显增强。而加入LXA4干预后,E-cadherin的表达明显增强,Vimentin和Fibronectin明显减弱,Boc-2能部分阻断这种作用。Western blotting结果同免疫荧光结果,而调控EMT的关键基因Slug和Twist在LPS刺激后上调,加入LXA4后明显下调。2.LXA4促进HepG2细胞凋亡。LPS刺激后,HepG2细胞凋亡减少,Bcl-2表达增强,而加入LXA4干预后,HepG2细胞凋亡明显增多,同时Bcl-2表达减弱。流式细胞检测细胞周期发现,50nM的LXA4能有效促进HepG2细胞凋亡。3. LXA4能有效抑制LPS诱导的HepG2细胞的增殖。MTT结果显示100,200,400nM的LXA4均能有效抑制LPS诱导的HepG2细胞的增殖。我们同时检测了增殖指标核仁素（C23）和调控蛋白核干素（nucleostemin, NS）的表达变化。免疫荧光、RT-PCR和western blotting结果发现LXA4能有效抑制C23和NS的表达,并且呈浓度依赖。同时我们还发现,LXA4能够通过抑制NF-κBp65来调控增殖。SiRNA沉默LX受体（FPRL1）后,LXA4抗增殖作用消失。4.临床标本观察发现,与癌旁正常组织相比,肝癌组织内有更多的白细胞和巨噬细胞浸润,说明巨噬细胞参与了肝癌的演进过程。我们还发现肝癌组织内表达更多的VEGF。5.LXA4能有效抑制ACM诱导的HepG2细胞的增殖。MTT结果显示,ACM能有效促进HepG2细胞增殖,而LXA4能抑制其诱导的增殖。RT-PCR, western blotting和免疫荧光结果显示LXA4能抑制ACM诱导的C23和NS的表达上调,并能抑制NF-κBp65的转位,抑制IκBα的降解。JNK特异性阻断剂SP600125能减弱LXA4的作用。6.LXA4能有效抑制LPS或ACM诱导的HepG2细胞的迁移增加及VEGF增高。LPS或者ACM能加快HepG2细胞的迁移,而LXA4能抑制迁移。LPS显著提高了VEGF表达水平,VEGF表达水平从1023.4 pg/ml上升至1285.0 pg/ml（P<0.05）,200nM和400nM LXA₄能分别降低其表达水平至748.5和547.5pg/ml （P<0.05）。U937/ACM使VEGF水平从对照组的578.7 pg/ml上升至745.6 pg/ml （P<0.05）,而加入LXA4后,VEGF降低至547.5 pg/ml,与U937/ACM相比明显降低（P<0.05）。7.LXA4能抑制ACM诱导的HepG2细胞发生EMT转变。HE染色发现,四种不同来源（包括U937, THP-1, RAW264.7和PBMCs）的ACM均能促进HepG2发生EMT转变,而LXA4能有效抑制其诱导的EMT转变。8.体内实验中BML-111对H22荷瘤小鼠原发瘤及肺转移的抑制作用。PBS组,肿瘤组织与其周边组织边界不清楚,包膜不完整,肿瘤组织侵犯脂肪组织；而BML-111组,肿瘤组织与其周边组织边界非常清楚,包膜完整。PBS组,肿瘤内血管丰富,不见坏死；而BML-111组,肿瘤内血管稀少,伴有坏死。TUNEL染色结果发现,BML-111处理后,肿瘤细胞凋亡明显增加。PBS组,NS的表达主要位于肿瘤内部；而BML-111组,肿瘤组织没有表达,NS表达在肿瘤组织和周围正常组织交界的部位。另外,BML-111组表达VEGF水平较低。我们以CD68和CD45分别作为巨噬细胞和白细胞的标记物,与PBS组相比,BML-111组两种细胞的浸润明显减少。在肺组织内,我们发现PBS组肺内出现明显转移瘤,转移瘤在肺内呈结节样分布。高倍镜下观察,肿瘤异型性明显,且与原发瘤具有共同特征。而BML-111组,肺野清晰,无转移瘤。9.LXA4抑制肿瘤转移的机制。体外实验中,免疫荧光结果发现,LXA4能有效抑制LPS诱导的OPN表达上调,RT-PCR结果显示LXA4的这种作用能被ERK特异性阻断剂,PD98059阻断。LXA4同时也下调MMP9的表达。Western blotting结果显示,50,100,200和400nM的LXA4均能增加E-cadherin的表达,下调Vimentin的表达,并下调P53的表达。但是50nM LXA₄抑制P53的作用最强,而200nM LXA₄对E-cadherin和Vimentin的调节作用最强。体内实验中,我们发现,BML-111能下调原发瘤内骨桥蛋白（osteopontin, OPN）和P53的表达,而上调E-cadherin的表达。实验结论1.LXA4能有效抑制LPS诱导HepG2细胞发生的EMT转变,Boc-2能够减弱这种效应；2.LXA4促进HepG2细胞发生凋亡；3.LXA4通过NF-κB抑制LPS诱导的HepG2细胞增殖；4.LXA4通过NF-κB和JNK通路抑制ACM诱导的HepG2细胞增殖；5.LXA4能有效抑制ACM诱导HepG2细胞发生的EMT转变；6.LXA4能抑制LPS或ACM诱导的HepG2细胞迁移加快和VEGF表达增多；7.体内实验中,BML-111抑制H22荷瘤小鼠原发瘤中肝癌细胞的增殖,血管新生,侵袭和炎细胞浸润,并促进肝癌细胞凋亡；8.LXA4和BML-111可能是通过ERK通路下调OPN, P53和MMP9,上调E-cadherin发挥其抗肿瘤转移效应。第二部分脂氧素A4通过ERK通路下调Nrf2抑制肝癌实验背景肿瘤的发生和发展是一多步骤的复杂的过程,在这一过程中,一些化学性的因素能够引起内源性的氧自由基（reactive oxygen species,ROS）释放,参与了肿瘤细胞的杀伤过程。核因子E2相关因子2（Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）,参与了这一过程,并引起相关的解毒酶和抗氧化酶释放包括醌氧化还原酶（quinone oxidoreductase-1,NQO 1）,血红素加氧酶（heme oxygenase-1,HO-1）,谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPx）,超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase,MnSOD）和谷氨酰半胱氨酸合成酶（glutamate-cystein ligase catalytic subunit,GCLC）合成,从而保护肿瘤细胞免受损伤。而我们前期的研究结果发现,脂氧素A4（LXA4）能够调控小鼠RAW264.7中ROS的产生及清除。我们推测LXA4可能通过调控Nrf2来抑制肝癌。实验目的研究LXA4在调控LPS诱导的HepG2细胞Nrf2和下游二期酶中的作用及其机制,同时也研究LXA4是否能提高HepG2细胞对化疗药物的敏感性。实验方法临床标本检测Nrf2及其二期解毒酶和抗氧化酶在肝癌组织及癌旁组织中的表达情况。体内实验观察BML-111是否能抑制H22荷瘤小鼠肿瘤组织内Nrf2的表达。体外实验观察LXA4对Nrf2的转位,二期酶的表达,ROS的产生,GPx和MnSOD的活性的影响。RNA干扰实验观察LXA4对Nrf2的调控是否为受体依赖。联合运用长春新碱（Vincristine,VCR）和LXA4用来观察LXA4是否能提高对化疗的敏感性。实验结果1.与癌旁组织相比,肝癌组织内Nrf2及二期解毒酶和抗氧化酶表达明显增高。RT-PCR实验发现肝癌组织内Nrf2及二期酶NQO1, HO-1, GPx, MnSOD和GCLC明显高于癌旁组织,免疫组化结果发现,Nrf2在肝癌组织内的阳性表达率为93.43％±0.05,显著高于癌旁组织的阳性表达率（3.93%±0.02）。2.BML-111抑制了H22荷瘤小鼠原发瘤组织中Nrf2的表达。BML-111处理小鼠后,Nrf2的表达（阳性表达率为69.07%±0.07）明显低于PBS组（阳性表达率为8.44％±0.03）。3.LXA4通过其受体FPRL1及抑制ERK下调LPS诱导的HepG2细胞Nrf2及其二期酶表达增高。LPS能在]mRNA水平上调Nrf2及其相关二期酶（NQO1,HO-1, GPx, MnSOD和GCLC）的表达,而LXA4能有效抑制其表达上调。PD98059能减弱这种效应。FPRL1-SiRNA转染HepG2细胞,下调Nrf2的作用消失。4.LXA4抑制LPS诱导HepG2细胞Nrf2核转位。免疫荧光结果发现,Nrf2在Control组细胞主要定位在胞浆。LPS刺激24 h后,Nrf2出现明显的核转位,而用LXA4处理后,这种核转位作用消失。Western blotting结果发现,虽然在LPS组和LPS+ LXA₄组,核内的Nrf2表达比胞浆高,LPS引起的核转位却能被LXA4明显抑制。5.LXA4抑制SOD和GPx的活性。LXA4能够明显下调SOD和GPx的活性,而PD98059能减弱这种效应。6.LXA4增加了ROS的产生。LXA4能够增加HepG2细胞内ROS的产生,而LPS能够下调ROS,并且PD98059能够减弱LXA4的效应。7.LXA4增加HepG2对VCR的化疗敏感性。形态学结果发现,VCR能够有效促进HepG2细胞死亡,而且当合用LXA4和VCR时,这种作用更为明显,而加入PD98059后该作用减弱。MTT实验发现,VCR+LXA₄组具有最强的抑制作用。Western blotting结果发现,VCR+LXA₄而能有效抑制Nrf2的表达及ERK1/2的磷酸化,PD98059能部分阻断这种作用,而VCR对Nrf2的作用甚微。从增殖角度来看,VCR+LXA₄能有效抑制C23的表达,在四组内,VCR+LXA₄组C23表达水平最低。实验结论1.肝癌组织内Nrf2异常激活；2.BML-111能有效抑制H22荷瘤小鼠原发瘤内Nrf2的表达；3.LXA4能够通过ERK通路下调HepG2细胞内Nrf2的表达,其机制是抑制Nrf2的核转位；4.LXA4增加HepG2对VCR的化疗敏感性。其机制是通过抑制ERK的磷酸化。