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目的:构建β3GnT8 RNA干扰细胞株探讨β3GnT8对于β3GnT2、MMP2、TIMP2基因mRNA表达水平的影响以及检测β3GnT2和β3GnT8在胃癌、恶性脑胶质瘤、乳腺癌癌细胞株中表达水平并构建其真核细胞表达载体。
方法:RT—PCR法检测β3GnT2、β3GnT8在上述三类癌细胞株中的表达;将β3GnT8 RNA干扰载体pSilenCircle-T8Si及对照载体转染胃癌细胞株SGC-7901,G418筛选稳定转染细胞株,RT-PCR检测β3GnT8、β3GnT2、MMP2、TIMP2 m RNA水平的表达,Western blot检测各组细胞中β3GnT8蛋白表达水平;PCR扩增带酶切位点β3GnT2、β3GnT8全长编码片段并构建真核表达载体p EGFP-C1-β3GnT2、pEGFP—C1—β3GnT8。
结果:β3GnT2、β3GnT8在上述癌细胞株中均有表达,胃癌细胞株中β3GnT8表达稍高;荧光显微镜观察、RT-PCR、Western blot证实成功构建胃癌SGC-7901β3GnT8 RNA干扰下调细胞株,RT—PCR检测β3GnT2表达没有显著变化;带酶切位点β3GnT2、β3GnT8全长编码片段成功扩增并连接至pEGFP-C1载体上。
结论:β3GnT2、β3GnT8共同表达于多种癌细胞株中,β3GnT8在m RNA水平影响MMP2的表达;成功克隆β3GnT2、β3GnT8全长编码片段并构建真核表达载体pEGFP—C1-β3GnT2、pEGFP—C1—β3GnT8,并构建成功β3GnT8 RNA干扰细胞株SGC-7901,为进一步的功能研究奠定了基础。