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目的:观察在不同时间节段下电针联合丰富康复训练干预Ang/Tie-2信号转导通路相关因子血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)、内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体(endothelium-specific receptor tyrosine kinase 2,Tie-2)表达的影响,研究在不同时间节段、不同干预方法下,局灶性脑缺血大鼠缺血侧神经功能恢复与血管新生的情况差异,并探讨可能存在的作用机制。以便将传统的针灸方法与现代康复技术相结合,并提供实验依据,以期可在临床上进行有效合理的使用。方法:1.从实验动物中心购入170只清洁级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,通过随机数字表法,将其中的27只大鼠划分为假手术组,剩余的143只大鼠通过Zea Longa改良线栓法建立MCAO模型。然后筛选出符合双重评分标准的108只大鼠,随机分为4组,模型组(27只)、电针组(27只)、康复组(27只)和针刺联合康复训练组(简称针康组)(27只),根据疗程的不同,将五组再细化分为3天、7天、14天,三个时间段。2.治疗组大鼠于术后麻醉清醒时(约在术后2-3小时)即可进行干预治疗。电针组与电针联合康复组(针康组)选取“百会”“风府”,辅以“内关”“心俞”作为刺激穴位;康复组与针康组同样于术后2-3小时进行康复疗法干预,提供丰富康复环境和康复运动训练;假手术组与模型组常规喂养,不进行任何治疗。五组大鼠连续治疗或喂养3天、7天、14天后,取材观察。3.采纳两种类型神经功能缺损体征评分(Zea Longa的5分制评分标准和改良m NSS16分制评分)在术后四个时间节段(4小时、3天、7天、14天)评估五组大鼠神经功能损伤和恢复情况;利用激光多普勒血流仪观察五组实验大鼠在四个时间节段(插线后5分钟,干预3天、7天、14天)局部脑血流量;利用TTC染色法观察脑组织的受损区域;通过HE染色法观察五组大鼠在三种不同时间节段(干预3天、7天、14天)缺血区大脑皮层病理学改变;采用Western Blot、RT-q PCR观察五组大鼠在三种不同时间节段(3天、7天、14天)、不同干预方式下(电针、康复训练、电针联合康复训练)Ang-1和Tie-2蛋白与基因表达情况;通过免疫组化法和Weidner法观察微血管密度。结果:1.神经功能缺损评分1.1 Zea Longa的5分制评分假手术组术后四个时间节段(4小时、3天、7天、14天)的大鼠按照评分标准分值均为0分,与假手术组相比,模型组大鼠术后四个时间节段评分均高于假手术组(P<0.01),并且随时间节段的增加呈逐渐降低趋势;与模型组相比较,电针组和康复组在干预4小时、3天时无显著性差异(P>0.05),干预7天、14天时评分均低于模型组有极显著性差异(P<0.01);针康组与模型组比较,3天、7天、14天三个时间段评分均低于模型组,有极显著性差异(P<0.01);针康组与电针组、康复组比较,术后4小时时无明显差异(P>0.05),在干预3天时,针康组评分低于电针组(P<0.05),与康复组差异无统计学意义(P>0.05),7天、14天时针康组评分均低于电针组与康复组,有明显差异(P<0.05或P<0.01);电针组与康复组比较,4小时、3天、7天、14天四个时间节段均无明显差异(P>0.05)。且从总体趋势观察,随着电针联合丰富康复训练治疗手段干预期的延长,大鼠神经功能恢复状态愈佳。1.2改良m NSS16分制评分标准术后,假手术组四个时间节段下(4小时、3天、7天、14天)大鼠的评分均为0分,与假手术组比较,模型组大鼠术后四个时间节段评分均高于假手术组(P<0.01)并且随时间节段的延长呈逐渐降低趋势;电针组、康复组与模型组比较,术后4小时差异无统计学意义(P>0.05),干预3天、7天、14天时评分均低于模型组,有极显著性差异(P<0.01);针康组与模型组比较,3天、7天、14天三个时间段评分低于模型组,有极显著性差异(P<0.01);针康组与电针组、康复组比较,干预4小时、3天时无明显差异(P>0.05),干预7天、14天评分低于电针组与康复组,有明显差异(P<0.05或P<0.01);电针组与康复组比较,4小时、3天、7天、14天四个时间段均无明显差异(P>0.05)。2.局部脑血流量(r CBF)术后,假手术组四个时间节段下(5分钟、3天、7天、14天)的大鼠脑血流量约稳定在200Pu左右,与假手术组相比,模型组大鼠术后四个时程血流量均低于假手术组(P<0.01);与模型组相比较,电针组和康复组在干预5分钟、3天时无显著性差异(P>0.05),干预7天、14天时血流量高于模型组,有极显著性差异(P<0.01);针康组与模型组比较,3天、7天、14天三个时间段脑血流量均高于模型组,有极显著性差异(P<0.01);针康组与电针组、康复组比较,术后5分钟时无明显差异(P>0.05),干预3天、7天、14天时针康组大鼠脑血流量高于电针组与康复组,有极显著性差异(P<0.01);电针组与康复组比较,5分钟、3天、7天、14天四个时间段均无明显差异(P>0.05)。3.病理组织学观察假手术组:大鼠缺血灶区域脑组织的细胞结构未见明显缺失,血管内皮细胞、胶质细胞排列有序,结构紧密、层次分明,脑组织内神经细胞胞浆丰富、核仁清晰无明显深染情况,神经元;术后3天组:改变最为明显,四组(模型组、电针组、康复组、针康组)都呈现间质水肿,神经细胞肿胀且疏密不均,神经细胞深染,四组镜下暂时未见明显差异;术后7天组:电针组与康复组脑组织间隙减少,倾向轻微排序状态,与模型组相比脑组织损伤后间质水肿等情况明显减轻,修复程度较好,针康组较其他组有明显减轻;术后14天组,三组治疗组的缺血脑组织内细胞的水肿情况可见显著改善,细胞结构、数量日趋正常化可见清晰胞核在其中,层次分明,排列有序,形态和数量分布趋于正常,胞浆均匀,损伤程度较其他时间点治疗组显著减轻。其中针康组在相同的治疗时间下改善情况最为明显。4.Western Blot检测Ang-1、Tie-2蛋白表达量术后,假手术组三个时间节段下(3天、7天、14天)大鼠缺血侧血管生成素-1(Ang-1)与内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体(Tie-2)未见明显改变;与假手术组比较,模型组大鼠术后三个时间段Ang-1、Tie-2表达量均高于假手术组,并具有统计学意义(P<0.01);治疗组中电针组、康复组与模型组比较,干预3天、7天、14天时电针组与康复组Ang-1、Tie-2表达量均高于模型组,有极显著性差异(P<0.01);针康组与模型组比较,干预3天、7天、14天三个时间段Ang-1、Tie-2表达量均高于模型组,有极显著性差异(P<0.01);针康组与电针组、康复组比较,干预3天、7天、14天时Ang-1、Tie-2表达量高于电针组与康复组,有明显差异(P<0.05或P<0.01);电针组与康复组比较,3天、7天、14天三个时间段均无明显差异(P>0.05)。5.RT-q PCR检测Ang-1m RNA、Tie-2 m RNA表达量术后,假手术组三个时间节段下(3天、7天、14天)大鼠缺血侧Ang-1m RNA、Tie-2 m RNA未见明显改变;与假手术组比较,模型组大鼠术后三个时间段Ang-1m RNA、Tie-2 m RNA表达量均高于假手术组(P<0.01或P<0.05);治疗组中电针组、康复组与模型组比较,干预3天、7天、14天时Ang-1m RNA、Tie-2 m RNA表达量高于模型组,有极显著性差异(P<0.01);针康组与模型组比较,干预3天、7天、14天时Ang-1m RNA、Tie-2 m RNA表达量高于模型组,有极显著性差异(P<0.01);针康组与电针组、康复组比较,干预3天、7天、14天Ang-1m RNA、Tie-2 m RNA表达量均高于电针组与康复组,有明显差异(P<0.05或P<0.01);电针组与康复组的Ang-1m RNA表达量相比,干预7天时两组无明显差异(P>0.05),干预3天、14d天时电针组低于康复组(P<0.05);电针组与康复组的Tie-2 m RNA比较,3天、7天、14天三个时间段均无明显差异(P>0.05)。6.免疫组织化学(IHC)检测Ang-1、Tie-2阳性细胞的表达术后,假手术组三个时间节段下(3天、7天、14天)大鼠缺血侧Ang-1、Tie-2阳性细胞未见明显改变,都仅有微量表达;与假手术组比较,模型组大鼠术后三个时间节段Ang-1、Tie-2阳性细胞数高于假手术组(P<0.01或P<0.05);电针组、康复组与模型组比较,干预3天、7天、14天时Ang-1、Tie-2阳性细胞数高于模型组,有极显著性差异(P<0.01或P<0.05);针康组与模型组比较,干预3天、7天、14天时Ang-1、Tie-2阳性细胞数高于模型组,有极显著性差异(P<0.01);针康组与电针组、康复组比较,干预3天、7天、14天Ang-1、Tie-2阳性细胞数均高于电针组与康复组,有明显差异(P<0.01);电针组与康复组比较,3天、7天、14天三个时间段均无明显差异(P>0.05)。7.微血管密度(MVD)术后,假手术组三个时间节段下(3天、7天、14天)大鼠缺血侧微血管密度(MVD)未见明显改变,都仅有微量表达;与假手术组比较,模型组大鼠术后三个时间段微血管密度(MVD)高于假手术组(P<0.01或P<0.05);电针组、康复组与模型组比较,干预3天、7天、14天时微血管密度高于模型组,有极显著性差异(P<0.01);针康组与模型组比较,干预3天、7天、14天时微血管密度高于模型组,有极显著性差异(P<0.01);针康组与电针组、康复组比较,干预3天、7天、14天微血管密度较高,有明显差异(P<0.05或P<0.01);电针组与康复组比较,3天时无明显差异(P>0.05),干预7天、14天时康复组高于电针组有差异(P<0.05或P<0.01)。结论:1.三种治疗方式(电针、康复训练、电针联合康复训练)可促进MCAO大鼠神经功能损伤修复,增加损伤侧血流供应,恢复脑组织功能、并对损伤侧脑组织有显著的病理学改善。联合疗法疗效优于单一疗法,电针与康复相结合可起到互相辅助互为补充的最佳效果2.电针联合康复训练能够上调Ang/Tie-2信号通路上Ang-1、Tie-2的表达量,增加缺血区微血管密度,促进损伤侧脑区的血管新生,联合疗法优于单纯电针疗法与康复疗法。