目的:通过复制2-AAF/PH大鼠肝癌前病变模型,观察体现“补肾生髓成肝”治疗法则的地五养肝胶囊对正常肝脏再生和肝癌前病变的作用及其机制,提出中医药防治肝癌前病变的新策略,丰富“肝主生发”(髓生肝、髓失生肝、补肾生髓成肝)的科学内涵,提高中医药防治肝癌的能力和水平。方法:采用SPF级Wistar大鼠复制2-AAF/PH大鼠肝癌前病变模型,将实验大鼠分为4组(每组16只),正常对照组(10 ml/kg/日生理盐水灌胃)、假手术对照组(2AAF+假手术+10 ml/kg/日生理盐水灌胃)、模型组(PHx+2AAF+10 ml/kg/日生理盐水灌胃)、DWYG组(PHx+2AAF+10 ml/kg/日地五养肝胶囊灌胃),每组从实验开始分别实施上述干预,至到不同时间点处死实验动物。按肝大部切除术后第8、10、14、17、19、22天不同时间点分6批处死实验动物,共384只实验大鼠,统计不同时间点大鼠死亡数,Log-rank法比较大鼠生存曲线。获取肝组织标本和股骨标本,显微镜下观察肝脏病理变化;并采用免疫组化方法观察肝组织内卵圆细胞标志物CD34、AFP、CK19,造血细胞标志物CD45、Thy1.1,肝细胞标志物ALB表达;采用percoll密度梯度分离骨髓细胞中的单个核细胞,运用流式细胞术检测单个核细胞中的CD34+CD45双阳性细胞;运用Bio-Rad公司Bio-plex悬液芯片系统检测再生肝组织内的与肝再生密切相关的细胞因子;运用Western blot法检测AFP、CK19、Thy1.1、ALB、Wnt1、Wnt3、β-catenin、FZD2、GSK3β、C-myc、cyclin D1、EpCAM蛋白表达。结果:DWYG组的生存曲线一直在模型组之上,并获得统计差异,(p<0.05,n=96),提示DWYG组2-AAF/PH大鼠的生存预后优于模型组。不同时间点单位视野内细胞核数目比较结果:术后第8天,模型组(718.00000±131.75740)高于空白组(487.33330±74.44640);术后第10天,模型组(675.44450±123.33200)高于空白组(467.83330±104.62010)和假手术组(416.55550±87.40296);术后第14天,模型组(778.571 40±74.99079)高于空白组(406.50000±73.45941)和假手术组(418.00000±98.00638);术后第17天,模型组(985.83330±459.18690)高于空白组(466.50000±52.62984)和假手术组(483.22220±79.32808);术后第19天,模型组(932.33330±194.63780)高于空白组(450.16670±52.94305)和假手术组(546.88890±145.07880);术后第22天,模型组(1030.8330±150.81830)高于空白组(407.33330±29.40521)和假手术组(645.3333±186.0255);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第10天,dwyg组(790.66670±155.25290)高于空白组(467.83330±104.62010);术后第14天,dwyg组(632.88890±213.65130)高于空白组(406.50000±73.45941);术后第17天,dwyg组(894.58330±166.37060)高于空白组(466.50000±52.62984);术后第22天,dwyg组(794.83330±246.67020)高于空白组(407.33330±29.40521);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点单位视野内细胞核面积总量比较结果:术后第10天,模型组(354634.1±61307.27)高于假手术组(193935.7±66317.37);术后第14天,模型组(545256.9±139460.2)高于空白组(266762.6±81448.47)和假手术组(267810.2±68476.35);术后第17天,模型组(649764.0±352785.3)高于空白组(215684.8±49102.53)和假手术组(237966.6±41024.46);术后第19天,模型组(931558.5±556737.7)高于空白组(233773.8±38409.17)和假手术组(302993.2±142219.0);术后第22天,模型组(577851.2±185634.6)高于空白组(214124.7±37308.11);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第17天,dwyg组(614474.5±152446.6)高于空白组(215684.8±49102.53);术后第19天,dwyg组(403424.6±126890.8)低于模型组(931558.5±556737.7);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点单位视野内细胞核平均直径比较结果:术后第10天,模型组(25.30816±1.31760)高于假手术组(23.06589±1.16258);术后第17天,模型组(25.85540±1.61349)高于假手术组(23.39901±0.62696);术后第19天,模型组(29.70243±4.58321)高于空白组(24.37762±0.60042)和假手术组(24.08170±2.40167);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点单位视野内细胞核iod值比较结果:术后第8天,模型组(151210.50±52440.44)高于假手术组(88003.13±11347.88);术后第17天,模型组(235629.80±119848.80)高于空白组(94303.05±22828.83)和假手术组(90270.37±13371.88);术后第19天,模型组(280996.10±121112.60)高于空白组(98838.04±3774.729)和假手术组(101573.60±46453.50);术后第22天,模型组(214187.60±61403.04)高于空白组(92825.63±21232.69);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第17天,dwyg组(226990.10±47799.56)高于空白组(94303.05±22828.83);术后第19天,dwyg组(133893.80±35922.41)低于模型组(280996.10±121112.60);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点肝癌前病变(肝组织结节数)比较结果:术后第8天,模型组(15.33333±2.08167)高于假手术组(3.66667±2.08167);术后第10天,模型组(12.33333±3.78594)高于假手术组(2.66667±0.57735);术后第14天,模型组(14.33333±5.50757)高于假手术组(1.00000±1.00000);术后第17天,模型组(10.00000±1.00000)高于假手术组(0.66667±0.57735);术后第19天,模型组(4.66667±1.15470)高于假手术组(1.66667±1.52753);术后第22天,模型组(2.33333±0.57735)高于假手术组(0.00000±0.00000);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01。术后第8天,dwyg组(9.33333±2.51661)低于模型组(15.33333±2.08167);术后第22天,dwyg组(0.66667±0.57735)低于模型组(2.33333±0.57735);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01。不同时间点afp的od值比较:术后第17天,模型组(0.00143±0.00279)高于空白组(0.00005±0.00011);术后第19天,模型组(0.00504±0.00494)高于空白组(0.00101±0.00213);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第14天,dwyg组(0.00704±0.00621)高于空白组(0.00181±0.00175),经统计学处理,差异显著,p<0.05。术后第14天,dwyg组(0.00704±0.00621)高于模型组(0.00030±0.00032);术后第17天,dwyg组(0.00001±0.00003)低于模型组(0.00143±0.00279);术后第19天,dwyg组(0.00144±0.00273)低于模型组(0.00503±0.00494);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点cd34的od值比较:术后第19天,模型组(0.00106±0.00149)高于空白组(0.00000±0.00001);术后第22天,模型组(0.00004±0.00004)高于空白组(0.00000±0.00000),以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第17天,dwyg组(0.00000±0.00000)低于模型组(0.00004±0.00006);术后第19天,dwyg组(0.00001±0.00002)低于模型组(0.00106±0.00149);术后第22天,dwyg组(0.00000±0.00000)低于模型组(0.00004±0.00004);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点ck19的od值比较:术后第17天,模型组(0.00836±0.00770)高于空白组(0.00015±0.00018);术后第8天,dwyg组(0.00714±0.00457)高于空白组(0.00154±0.00100);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第8天,dwyg组(0.00714±0.00457)高于模型组(0.00138±0.00215);术后第17天,dwyg组(0.00169±0.00229)低于模型组(0.00836±0.00770);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点cd45的od值比较:术后第8天,模型组(0.02223±0.01637)高于空白组(0.00063±0.00099);术后第10天,模型组(0.01182±0.00432)高于空白组(00.00000±0.00000);术后第22天,模型组(0.00062±0.00056)高于空白组(0.00001±0.00002);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第8天,dwyg组(0.00182±0.00336)低于模型组(0.02223±0.01637);术后第10天,dwyg组(0.00311±0.00680)低于模型组(0.01182±0.00432);术后第22天,dwyg组(0.00000±0.00000)低于模型组(0.00062±0.00056);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点thy1.1的od值比较:术后第19天,模型组(0.00488±0.00628)高于空白组(0.00028±0.00042),经统计学处理,差异显著,p<0.01。术后第19天,dwyg组(0.00116±0.00154)低于模型组(0.00488±0.00628),经统计学处理,差异显著,p<0.01。不同时间点alb的od值比较:术后第14天,模型组(0.00193±0.00228)alb的od值在高于空白组(0.00006±0.00008);术后第17天,模型组(0.01740±0.01170)高于空白组(0.00223±0.00196);术后第19天,模型组(0.00989±0.00447)高于空白组(0.00097±0.00121);术后第22天,模型组(0.00044±0.00019)高于空白组(0.00002±0.00002);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第14天,dwyg组(0.00030±0.00039)低于模型组(0.00193±0.00228);术后第17天,dwyg组(0.00092±0.00106)低于模型组(0.01740±0.01170);术后第19天,dwyg组(0.00602±0.00253)低于模型组(0.00989±0.00447);术后第22天,dwyg组(0.00009±0.00017)低于模型组(0.00044±0.00019);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点afp的蛋白表达水平比较:术后第17天,模型组(3.22937±0.67848)高于空白组(0.42980±0.00491);术后第17天,dwyg组(1.74258±0.40137)高于空白组(0.42980±0.00491);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第17天,dwyg组(1.74258±0.40137)低于模型组(3.22937±0.67848),经统计学处理,差异显著,p<0.05。不同时间点ck19的蛋白表达水平比较:术后第22天,模型组(0.97433±0.26563)高于空白组(0.49627±0.03081),经统计学处理,差异显著,p<0.05。术后第10天,dwyg组(0.78806±0.28183)高于模型组(0.22565±0.05949),经统计学处理,差异显著,p<0.01。不同时间点thy1.1的蛋白表达水平比较:术后第8天,模型组(0.99196±0.03836)高于空白组(0.50287±0.01344);术后第17天,模型组(5.54601±0.05300)高于空白组(0.59333±0.02435);术后第22天,模型组(3.75083±0.16050)高于空白组(0.53597±0.05286);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第8天,dwyg组(1.94592±0.22803)高于空白组(0.50287±0.01344);术后第10天,dwyg组(11.82147±5.36504)高于空白组(0.56464±0.06698);术后第17天,dwyg组(2.48814±0.26399)高于空白组(0.59333±0.02435);术后第22天,dwyg组(0.97038±0.10725)高于空白组(0.53597±0.05286);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第8天,dwyg组(1.94592±0.22803)高于模型组(0.99196±0.03836);术后第17天,dwyg组(2.48814±0.26399)低于模型组(5.54601±0.05300);术后第22天,dwyg组(0.97038±0.10725)低于模型组(3.75083±0.16050);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点alb的蛋白表达水平比较:术后第8天,模型组(0.27453±0.01486)低于空白组(1.03074±0.02754);术后第17天,模型组(1.84682±0.18736)高于空白组(1.14338±0.01306);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第8天,dwyg组(0.68833±0.23554)高于模型组(0.27453±0.01486),经统计学处理,差异显著,p<0.05。不同时间点cd34/cd45双阳性细胞率结果比较:术后第10天,模型组(1.36±0.10)高于假手术组(0.54±0.03)和正常对照组(0.80±0.10),经统计学处理,差异显著,p<0.05。术后第10天,dwyg组(1.51±0.11)高于模型组(1.36±0.10);术后第14天,dwyg组(1.32±0.05)高于模型组(0.64±0.05);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.05。不同时间点wnt-1的蛋白表达水平比较:术后第17天,模型组(1.32779±0.35836)高于空白组(0.36270±0.01673),经统计学处理,差异显著,p<0.05。不同时间点wnt-3的蛋白表达水平比较:术后第19天,模型组(1.85876±0.54423)高于空白组(0.11918±0.01016),经统计学处理,差异显著,p<0.01。术后第10天,dwyg组(0.04430±0.00041)低于空白组(0.10873±0.01290),经统计学处理,差异显著,p<0.01。术后第10天,dwyg组(0.04430±0.00041)低于模型组(0.09193±0.01315);术后第19天,dwyg组(0.23867±0.06112)低于模型组(1.85876±0.54423);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点β-catenin的蛋白表达水平比较:术后第14天,模型组(0.60503±0.25672)高于空白组(0.18496±0.00238),经统计学处理,差异显著,p<0.01。术后第17天,dwyg组(0.07359±0.02606)低于空白组(0.19992±0.00922),经统计学处理,差异显著,p<0.01。不同时间点fzd2的蛋白表达水平比较:术后第17天,模型组(0.76346±0.02471)高于空白组(0.47247±0.02180),经统计学处理,差异显著,p<0.01。术后第14天,dwyg组(0.13873±0.01626)低于空白组(0.43712±0.00564),经统计学处理,差异显著,p<0.01。术后第10天,dwyg组(0.86342±0.30096)高于模型组(0.41012±0.10035);术后第14天,dwyg组(0.13873±0.01626)低于模型组(0.29838±0.09992);术后第17天,dwyg组(0.38007±0.08595)低于模型组(0.76346±0.02471);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点gsk3β的蛋白表达水平比较:术后第14天,模型组(1.08911±0.04313)高于空白组(0.33607±0.00433);术后第22天,模型组(0.72570±0.09099)高于空白组(0.31403±0.03097);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第10天,dwyg组(9.06168±2.25561)高于空白组(0.33082±0.03924),经统计学处理,差异显著,p<0.01。术后第10天,dwyg组(9.06168±2.25561)高于模型组(1.36823±0.11584);术后第14天,dwyg组(0.39855±0.04579)低于模型组(1.08911±0.04313);术后第22天,dwyg组(0.20201±0.12896)低于模型组(0.72570±0.09099);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点c-myc的蛋白表达水平比较:术后第10天,模型组(0.38214±0.08574)高于空白组(0.10696±0.01269);术后第14天,模型组(0.41937±0.23529)高于空白组(0.10866±0.00140);术后第19天,模型组(0.25829±0.04226)高于空白组(0.11362±0.00875);术后第22天,模型组(0.05292±0.00212)低于空白组(0.10153±0.01001);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第10天,dwyg组(0.37789±0.07038)高于空白组(0.10696±0.01269),经统计学处理,差异显著,p<0.01。术后第19天,dwyg组(0.13076±0.03385)低于模型组(0.25829±0.04226),经统计学处理,差异显著,p<0.01。不同时间点cyclind1的蛋白表达水平比较:术后第17天,模型组(1.39008±0.00242)高于空白组(0.06501±0.00300),经统计学处理,差异显著,p<0.01。术后第10天,dwyg组(1.66466±0.27007)高于空白组(0.05921±0.00702);术后第14天,dwyg组(2.05675±0.83282)高于空白组(0.06015±0.00078);术后第17天,dwyg组(0.24702±0.05901)高于空白组(0.06501±0.00300);术后第22天,dwyg组(0.02090±0.01496)低于空白组(0.05620±0.00554);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。术后第10天,dwyg组(1.66466±0.27007)高于模型组(0.17641±0.05093);术后第14天,dwyg组(2.05675±0.83282)高于模型组(0.69284±0.29621);术后第17天,dwyg组(0.24702±0.05901)低于模型组(1.39008±0.00242);术后第22天,dwyg组(0.02090±0.01496)低于模型组(0.05703±0.00188);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.01或p<0.05。不同时间点epcam的蛋白表达水平比较:术后第19天,模型组(0.82235±0.13035)高于空白组(0.37034±0.02852),经统计学处理,差异显著,p<0.01。术后第14天,dwyg组(0.08119±0.03697)低于空白组(0.35418±0.00457),经统计学处理,差异显著,p<0.01。术后第14天,dwyg组(0.08119±0.03697)低于模型组(0.33000±0.03355),经统计学处理,差异显著,p<0.01。不同时间点il-1检测结果显示:与正常组(981.99±303.24)相比,模型组显著上调细胞因子il-1在术后第10天(3967.33±1966.02)、术后第19天(2230.46±1883.23)的表达,经统计学处理,未获得统计差异。术后第10天,dwyg组(1554.40±554.75)低于模型组(3967.33±1966.02);术后第19天,dwyg组(827.53±254.19)低于模型组(2230.46±1883.23);以上数据经统计学处理,均有显著性差异,p<0.05。不同时间点il-6检测结果显示:与正常组(614.93±287.00)相比,模型组显著下调细胞因子il-6在术后第10天(244.82±128.15)和术后第19天(241.52±5.28)的表达,经统计学处理,均获得统计差异,p<0.05。不同时间点gro/kc检测结果显示:与正常组(76.66±25.83)相比,模型组显著上调细胞因子gro/kc在术后第10天(575.22±241.02)、术后第14天(716.44±317.68)、术后第19天(115.15±67.89)的表达,经统计学处理,未获得统计差异。术后第14天,dwyg组(145.89±120.66)低于模型组(716.44±317.68),经统计学处理,获得统计差异,p<0.05。不同时间点ifn-γ检测结果显示:与正常组(167.83±90.62)相比,模型组显著下调ifn-γ在术后第10天(48.08±12.92)、术后第14天(48.2±16.95)、术后第19天(50.53±11.7)的表达,经统计学处理,均获得统计差异,p<0.05。不同时间点tnf-α检测结果显示:与正常组(440.9±114.57)相比,模型组显著下调tnf-α在术后第10天(138.77±35.82)、术后第14天(174.9±55.57)、术后第19天(152.39±41.05)的表达,经统计学处理,均获得统计差异,p<0.05。不同时间点VEGF检测结果显示:与正常组(147.74±35.31)相比,模型组显著上调细胞因子VEGF在术后第19天(274.25±200.09)的表达,经统计学处理,获得统计差异,p<0.05。术后第19天,DWYG组(101.42±7.55)低于模型组(274.2 5±200.09),经统计学处理,获得统计差异,p<0.05。结论:地五养肝胶囊具有促进正常肝脏再生和抗肝癌前病变的作用。地五养肝胶囊对卵圆细胞的增殖和分化具有双向调节作用:肝再生早期(肝切除术后8-14天),地五养肝胶囊促进肝内卵圆细胞和骨髓干细胞增殖和分化,有利于肝脏再生修复;肝再生晚期(肝切除术后17-22天),地五养肝胶囊抑制卵圆细胞的过度增殖和异常分化,有利于防治肝细胞癌变,抑制“髓失生肝”。其分子机制之一可能是地五养肝胶囊在肝切除术后8天或更早已激活Wnt/β-catenin通路,促进卵圆细胞的增殖以加速肝脏再生;而肝再生晚期(肝切除术后14-22天),地五养肝胶囊发挥抑制卵圆细胞的过度增殖和异常分化,有利于防治肝细胞癌变的作用,其机制可能是在更早的加速肝脏修复之后,地五养肝胶囊抑制了Wnt/β-catenin通路的持续激活,从而抑制卵圆细胞的过度增殖和癌变倾向。地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境影响骨髓干细胞和卵圆细胞的分化方向及其相关信号通路可能是其发挥抗肝癌前病变作用的生物学基础。