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基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一类锌离子依赖型内肽酶,属于金属蛋白酶类。MMPs的主要底物胶原蛋白是动物肌肉的重要组成成分,因此,MMPs参与肌肉蛋白新陈代谢,与肌肉质构变化密切相关。贝类是我国重要经济水产动物,但目前贝类MMPs基因的存在形式及MMPs与肌肉蛋白的相互作用关系却鲜有报道。本研究以皱纹盘鲍(Haliotis discus hanai)为研究对象,采用分子生物学技术克隆得到MMPs基因序列并利用大肠杆菌及毕赤酵母表达系统实现重组蛋白的异源表达,对MMPs在皱纹盘鲍不同组织中的相对表达量及其与鲍鱼肌肉蛋白的相互作用进行了初步研究。首先,利用同源克隆及RACE技术从皱纹盘鲍肌肉中克隆得到MMP-1(Hdh-MMP-1)及MMP-2(Hdh-MMP-2)基因cDNA序列。Hdh-MMP-1(GenBank登录号KR537291.1)cDNA全长2136 bp,其中开放阅读框(ORF)1551 bp,编码516个氨基酸,预测分子量58.94 kDa,理论等电点为5.99,其含有MMP家族典型的前肽区、催化区、铰链区及类血红素结合区。BLAST结果显示,Hdh-MMP-1与多种鲍类MMP-1、某些软体动物和虫类MMPs氨基酸序列相似。Hdh-MMP-2(Gen Bank登录号KX058128.1)基因1644 bp,预测分子量61.66 kDa,理论等电点为5.19,除MMP家族典型的区域外,还含有明胶酶特有的II型纤连蛋白结合区。Hdh-MMP-2与多种无脊椎软体动物及哺乳动物MMP-2具有序列相似性,表明该基因在不同物种间较保守。SOPMA预测结果显示Hdh-MMPs二级结构元件均含α螺旋结构,β转角结构,延伸链及无规卷曲。此外,分别以人MMP-1、大西洋鲑MMP-2作为建模模板,模拟了Hdh-MMPs的三级结构。其次,构建原核表达质粒pET-cMMP-1,利用大肠杆菌表达系统成功表达并纯化得到重组Hdh-cMMP-1,将其用于制备特异兔抗鲍鱼MMP-1多克隆抗体。同时,利用毕赤酵母真核表达系统成功表达分子量约为90 kDa的重组Hdh-MMP-1,明胶酶谱结果显示该蛋白具有降解明胶的生物活性。进一步构建表达质粒pET-cMMP-2及融合表达质粒MBP-cMMP-2并转入大肠杆菌表达宿主,成功诱导表达并纯化得到以包涵体形式及可溶形式表达的重组Hdh-cMMP-2。但两种表达方式获得的目的蛋白均无生物活性,此后对重组蛋白二级结构进行分析,并且与重组刺参MMP-2蛋白进行比较。最后,利用荧光定量PCR研究了Hdh-MMPs基因在皱纹盘鲍不同组织中表达量差异,结果显示,Hdh-MMPs基因在所检测的各组织中均有不同程度表达,且在血细胞及腮等免疫相关组织中表达量最高,表明Hdh-MMPs在皱纹盘鲍免疫调控环节具有一定生物功能。用致病菌副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)感染皱纹盘鲍,研究感染前后肌肉质构变化及Hdh-MMPs基因相对表达量变化情况。结果显示,一次染菌后鲍鱼肌肉Hdh-MMPs基因表达水平均显著上调(p<0.05)随后降低。而多次染菌后鲍鱼肌肉硬度明显下降(p<0.05),且Hdh-MMPs基因表达量显著上调(p<0.05),表明皱纹盘鲍MMPs参与其肌肉蛋白质降解,与肌肉质构变化有关。