在过去的三十年，整个人类的生育能力在逐渐降低。不孕症是现在世界上1/6的夫妇主要的健康问题。其中男性生殖功能紊乱占很大比例，目前大部分男性的病因仍不能被解释。男性不育症常见的病因包括精子运动能力低下和精卵结合力降低。精子在睾丸中完成形态分化，只有在通过附睾的过程中，精子经历一系列复杂的变化后，才能获能而达到功能上的成熟，并在附睾内储存。附睾是由大量的曲细精管构成，在形态学和功能学上有明显的区域划分，包括起始部、头部、体部、尾部。附睾上皮有四种不同形态的细胞分布，而每一种细胞均参与形成并调节附睾管腔液体的酸性环境，以此维持精子的浓缩、成熟、储存、趋化运动。精子在附睾中成熟和储存过程需要一个低碳酸氢盐和低pH的环境来维持精子静息状态。附睾上皮细胞作为一个整体，能够协同作用，建立和维持附睾酸性微环境。亮细胞在顶膜上表达高水平的V-ATP酶，通过ATP供能把质子泵入附睾管腔中，亮细胞胞浆内的可溶性腺苷酸环化酶(sAC)是一种HCO3-依赖性的化学感受器，可以直接被HCO3-激活，从而使cAMP浓度升高，导致V-ATP酶在顶膜上的聚集。主细胞能够分泌HCO3-至附睾管腔。而来自于精子和主细胞的ATP被释放入管腔，且有狭长突起的基细胞能够特异性地表达ANGII的II型受体(AGTR2)，这些受体受到ANGII的刺激后，能够使V-ATP酶在附睾亮细胞的顶膜面微绒毛聚集。ANGII可以作用于附睾上皮基细胞腔膜面上的受体，激活了NO的产生，NO经过旁分泌进入亮细胞内，激活sGC，sGC继而引发了cGMP介导的V-ATP酶在亮细胞微绒毛的聚集。由此，附睾上皮主细胞和亮细胞、基细胞和亮细胞之间形成复杂的协同关系，共同维持管腔液的酸性环境。而关注和破译这些胞内的对话能够帮助我们定义男性生殖系统的发育机制。受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(regulated upon activation normal T cellexpressed and secreted，RANTES)，最初被认为是一种典型的趋化性细胞因子。RANTES被报道具有多重的生理学和病理学效应，例如在免疫学效应上，RANTES不但具有抑制HIV病毒复制的能力，而且在特定的环境下能增强复制，且对肿瘤有一定的诱导和促生长作用。RANTES通过4种趋化因子受体传导信号，包括CCR1、CCR3、CCR4和CCR5，均属于7次跨膜G蛋白偶联受体家族成员。其中CCR1和CCR5属于高亲和力受体。我们目前的研究认为RANTES特异性高表达在附睾组织，在精子成熟过程中具有非常重要的作用。之前我们已明确基细胞作为附睾管腔环境的感受器能与亮细胞协同作用。具体来说，基细胞释放NO调节邻近亮细胞，调控其V-ATPase依赖的质子分泌，同时基细胞能够特异性地表达ANGII的II型受体(AGTR2)，这些受体受到附睾管腔内ANGII的刺激后，也能够促使亮细胞泌酸。有文献报道RANTES可以促进巨噬细胞释放NO，而基细胞的超微结构与巨噬细胞极其相似，被认为是附睾管腔内固定的巨噬细胞。由此推测RANTES可能在ANGII的刺激下通过自分泌方式，激活基细胞释放NO，再经NO信号通路，在基细胞与亮细胞的串话调节中发挥作用，进而协助维持附睾管腔液体的酸性环境。为了研究RANTES在附睾酸性微环境中的作用，本实验首先检测了RANTES在正常大鼠附睾内的表达，进而利用输精管切除术构建附睾酸性微环境破坏的模型，对比观察手术组和假手术组RANTES的变化，证明RANTES参与调节附睾管腔酸性微环境的作用，为深入探讨该分子在精子成熟过程中的重要作用与具体机制提供新的依据。本实验分为以下两个部分：第一部分：RANTES在大鼠附睾的表达与定位通过PCR、Western blot和免疫组织化学法等技术检测大鼠附睾RANTES及其受体CCR1、CCR5的表达，主要结果如下：1、PCR结果显示RANTES mRNA在大鼠附睾有表达。Western blot检测到RANTES蛋白在大鼠附睾头部、尾部有较高表达，在体部的表达量相对较低。免疫组织化学法检测结果提示，RANTES在附睾管上皮的上皮细胞有高表达。免疫荧光双标实验利用基细胞特异性细胞标记物COX1，进一步证实了RANTES定位在附睾上皮的基细胞。2、PCR结果显示RANTES受体CCR1和CCR5mRNA在附睾均有表达，Westernblot检测到CCR1、CCR5蛋白在大鼠附睾头部、体部和尾部均有表达。免疫组织化学实验表明受体CCR1、CCR5在附睾上皮表达于基细胞。免疫荧光双标染色分别检测RANTES与CCR1、CCR5的细胞共定位情况，显示RANTES与CCR1、CCR5在附睾管的基细胞共存。以上结果表明：RANTES与CCR1、CCR5共定位在附睾管的基细胞，推测RANTES可能通过自分泌方式在大鼠附睾基细胞功能活动方面起重要作用。为了证实这个推测，我们进行第二部分的模型研究。第二部分：附睾酸性环境被破坏后，RANTES及其受体的表达变化建立大鼠输精管切除术后附睾管腔酸性微环境被破坏的动物模型，采用放射免疫分析技术检测附睾组织匀浆液上清内ANGII水平的变化；Real time PCR检测ANGII受体AGTR2mRNA水平的变化，Western blot检测AGTR2蛋白水平的变化后；进一步通过Real time PCR、Western blot观察RANTES及其受体在mRNA以及蛋白水平的表达变化，并用Real time PCR、Western blot检测iNOs mRNA水平和蛋白水平的变化。主要结果如下：1、检测大鼠附睾管腔pH值，pH值增高，说明模型建立成功，实验可用。输精管切除术后，附睾管腔酸性微环境被破坏，ANGII水平显著下调，AGTR2mRNA和蛋白水平明显降低；2、实时定量PCR证明手术组与假手术组相比，RANTES在大鼠附睾头部、体部和尾部的表达水平明显降低。Western blot显示，RANTES及其受体CCR1、CCR5在大鼠附睾头部、体部和尾部的表达水平明显下降。3、iNOs在大鼠附睾头部、体部和尾部的mRNA和蛋白水平显著降低。这些结果显示输精管切除术后影响了附睾管腔酸性微环境的改变，RANTES及其受体的表达量降低，表明RANTES对维持附睾管腔酸性微环境具有积极的作用。该结果与我们第二部分的推测一致。总之，我们的研究结果表明RANTES可能在ANGII的刺激下通过自分泌方式，激活基细胞释放NO，再经NO信号通路，在基细胞与亮细胞的串话调节中发挥作用，从而协助维持附睾管腔液的酸性环境。维持精子处于静息状态，其具体机制还有待我们在细胞水平深入的实验研究。