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目的胆道肿瘤(BTC)是一种极度恶性的肿瘤,由于缺乏有效的早期诊断方法,具有极高的死亡率,因此寻找胆道肿瘤的早期诊断方法显得尤为重要。在本论文中,我们从两个方面对胆道肿瘤的早期诊断方法进行研究:一方面,有文献报道高尔基蛋白73(GP73)在胆道肿瘤患者的血清中具有很高浓度,可以作为胆道肿瘤的诊断指标以期用于BTC的早期筛查和诊断。我们基于此构建一种检测GP73的新型电化学免疫检测方法,以实现精确检测血清中的分泌型GP73,并用于胆道肿瘤的诊断和病情评估。另一方面,雄激素受体等基因中(CAG)n三核苷酸重复的长度多态性与胆道肿瘤的发病情况密切相关,我们利用阿霉素的荧光特性、基于核酸二级结构提出一种快速检测三核苷酸重复长度多态性的方法。方法1.基于氧化石墨烯和量子点两种纳米材料,我们构建了一种新型电化学免疫传感器用于检测GP73。首先利用电化学还原氧化石墨烯的高导电性,获得导电能力良好的界面,从而可以将GP73抗体固定在电极上。当GP73抗体通过抗原抗体反应将样品中的GP73捕获到电极表面后,包被橙黄网胞盘菌凝集素的Cd Se量子点可与GP73表面的寡糖发生特异性凝集素-寡糖作用,从而结合到电极表面。这些电极表面的量子点便可通过Cd的阳极溶出产生放大的信号,其大小与GP73的浓度正相关。2.富含CG的(CAG)n三核苷酸重复序列会形成稳定的发夹结构,而阿霉素能够特异性嵌入该结构中的双链部分,从而导致其自身荧光的淬灭。因此以阿霉素为分子信号标记,可建立起荧光强度和重复次数的反比例定量关系,进而可以用于研究三核苷酸重复长度的多态性。结果1.实验构建的GP73检测方法可以实现在血清样本中检测GP73的目的。在优化条件下,检测方法具有满意的灵敏度,检测范围是20-5000 pM,最低检测限为12 p M。同时,该方法具有良好的重复性和特异性。对胆道恶性肿瘤患者术前和术后血清中GP73含量的检测发现,患者术后GP73含量明显降低,体现了手术治疗的效果。2.基于阿霉素荧光和核酸二级结构快速测定三核苷酸重复长度多态性的方法,可在三核苷酸重复的次数在10-35的范围内,线性测定三核苷酸重复的长度,借此可以测定PCR产物中(CAG)n重复的多态性。结论1.实验成功构建了一种基于氧化石墨烯和量子点的可灵敏的检测GP73的电化学免疫方法,实现了血清样本中GP73的检测,并可对胆道恶性肿瘤患者手术治疗效果进行初步评估。2.基于阿霉素荧光和核酸二级结构,我们成功构建一种快速测定三核苷酸重复长度多态性的方法。整个过程仅需30分钟,而且价格低廉,操作简单,反应灵敏,无需引入化学修饰,大大简化了(CAG)n三核苷酸重复长度多态性的研究。