芋螺毒素(conotoxin,CTx)是从药用海洋生物芋螺中分泌产生的一类具有生物活性的活性肽,因其具有种类繁多,结构新颖,选择性强等优点,并且在镇痛、成瘾和癌症等疾病方面可作为潜在的新药进行开发,具有很好的应用前景,在近几十年来已成为国际上研究的热点。本实验室从海南产将军芋螺(Conus generalis)中鉴定出一个新超家族芋螺毒素αO-GeXIVA。前期研究发现,四个半胱氨酸形成的三个异构体都是鼠源(rat,r)和人源(human,h)α9α10烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的阻断剂,活性大小为bead(GeXIVA[1,2])>ribbon(GeXIVA[1,4])>globular(GeXIVA[1,3]),其中 GeXIVA[1,2]和GeXIVA[1,4]的活性仅相差1.5倍。在大鼠坐骨神经慢性挤压伤(CCI)神经痛模型上,GeXIVA[1,2]和GeXIVA[1,4]都表现出极强的镇痛活性,并且GeXIVA[1,2]在停药一周后仍有镇痛作用,因此可作为镇痛新药进行开发。本研究在最强的异构体GeXIVA[1,2]和GeXIVA[1,4]上进行丙氨酸扫描突变,半胱氨酸替换以及序列截短方面的研究,探讨突变体对α9α10 nAChR活性的影响。丙氨酸(Ala,A)扫描突变的结果表明,GeXIVA[1,2]没有关键氨基酸位点,而GeXIVA[1,2]同时突变两个及两个以上精氨酸(Arg,R)时,活性大大降低甚至失活。但在GeXIVA[1,4]中,发现第22位的精氨酸和第23位的异亮氨酸(lie,I)在rα9α10 nAChR的活性分别比本体减弱和增强了 11倍。后续的研究我们还发现,[I23A]GeXIVA[1,4]不仅在鼠源其它nAChRs亚型上选择性最好,而且对hα9α10 nAChR的活性也增强了 10倍。为了探讨二硫键对GeXIVA的重要性,我们首先在GeXIVA[1,2]和GeXIVA[1,4]分别用其他氨基酸替换其中两个半胱氨酸(Cys,C)。电生理活性发现,所有突变体都保留了对ra9α10 nAChR的活性。在此基础上设计了没有半胱氨酸的突变体,结果同第一代突变体。其中一个突变体[C2A,C9A,C20S,C27S]GeXIVA在rα9α10和hα9α10 nAChRs的活性比GeXIVA[1,2]分别提高了 2倍和1.5倍。然后利用CD圆二色谱考察了所有突变体的二级结构变化,结果显示,只有保留α-螺旋的突变体与GeXIVA[1,4]结构是相似的,其余突变体的结构均与GeXIVA[1,2]相似。利用核磁共振(NMR)对[C2A,C9A,C20S,C27S]GeXIVA的结构进行解析,发现其αH-二级结构位移与GeXIVA[1,2]相似,说明二硫键对GeXIVA来说并不重要,没有二硫键不仅能节约合成成本而且还大大提高了产率。由于GeXIVA含有28个氨基酸,其氨基酸数量比其他作用于nAChR的α-CTx多一倍左右,不仅增加了合成成本而且在应用上也存在一定的局限性。根据GeXIVA的活性中心设计了一系列截短肽。在前期GeXIVA截短肽(Δ10-19GeXIVA)的基础上,设计了它的丙氨酸扫描突变体。在对rα9ct10 nAChR进行10 μM高浓度初筛时发现第5位的天冬氨酸活性提高了,其余突变体均丧失了活性。Δ10-19[D5A]GeXIVA的IC50值比Δ10-19GeXIVA提高了 10倍。然后又研究了 C末端酰胺化对其活性的影响,发现当Δ10-19[D5A]GeXIVA和Δ10-19GeXIVA进行酰胺化修饰后其活性都比未酰胺化的提高了 10倍左右,其IC50分别是16.5 nM和126 nM,得到的Δ1’[D5A]GeXIVA#的活性与 GeXIVA[1,2]相似。然后测试了Δ10-19[D5A]GeXIVA#在 Mα1β1&和 ra7 nAChRs 的活性,结果发现它对ra7的活性与GeXIVA[1,2]—致,而对Mα1β1δε的选择性则比GeXIVA[1,2]提高了 4倍。接着我们又设计了一个含有一对二硫键的截短肽Δ6-22GeXIVA。对rα9α10,Mαiβ1δε和rα7 nAChRs进行活性考察后发现,它在这三个受体的 IC50 值与 GeXIVA[I,2]相似。最后对Δ10-19[D5A]GeXIVA#和6-22GeXIVA 在h(a9α10 nAChR上进行活性检测,结果发现它们的活性与GeXIVA[1,2]相似。本研究还探讨了 TxID在体外物理和化学条件下的稳定性。首先在UPLC成功建立了检测方法,然后分别在光照、氧化、温度、pH、离子浓度等条件下进行考察。结果显示TxID对光照和离子浓度不敏感,而在其它条件下则不稳定。这为以后TxID的储存运输提供了有用的信息。