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本研究着重应用免疫学和生物化学方法,构建了基于ATP合酶的免疫旋转生物传感器,结合荧光技术检测CL。具体研究内容如下:
(1)应用重氮化两步偶联法将盐酸克伦特罗分别偶联到牛血清蛋白和卵清蛋白上制得了免疫抗原BSA-CL和包被抗原OVA-CL。用紫外分光光度法测定其偶联比率分别为39:1和24:1。
(2)用BSA-CL免疫兔获得了含有多克隆抗体的血清,经硫酸铵沉淀、纯化,得到兔源抗CL的抗体。在此基础上建立了间接酶联免疫吸附检测法,确定了抗CL抗体最适稀释度为1:1000,羊抗兔酶联抗体最适稀释度为1:1500。经测定,该方法的检测灵敏度可达0.1046μg/L,生物检测限为1.452μg/L,线性检测范围为7.26~90.75μg/L。
(3)用Ni-NTA亲合层析柱提取纯化了工程化嗜热菌BacillasPS3上的TF1β亚基,并用其免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合与克隆筛选获得2株分泌TF1β抗体的杂交瘤细胞株2D5和4E7。经扩大培养后接种小鼠,收集腹水,获得TF1β的单克隆抗体。
(4)从光合细菌R.rubrum中提取得到了其光合载色体chromatophores,经电镜观察chromatophores的平均直径为(76±16)nm。且具有较高的活性,可以作为研究ATP合酶水解和合成活性的实验材料。
(5)利用对pH变化敏感的荧光探针F1300标记到chromatophores膜内侧,通过荧光强度变化表征ATP合成引起的质子转运过程。研究发现,在chromatophores的β亚基上连接不同负载时,可以不同程度影响其ATP合成活性。在此基础上构建的IRB可以通过“β亚基抗体-生物素-亲和素-生物素-CL抗体”复合物捕获溶液中不同浓度的CL,表现出不同的荧光增长速率。IRB的捕获机制同常规ELISA一致,但其检测机制却又明显不同于ELISA一利用了ATP合酶在ATP合成过程中的质子转运特性通过检测荧光探针信号变化来反映,因此极大提高了检测灵敏度,其感应灵敏度可达10-12g/L。
(6)同时对气相色谱-质谱联用、荧光免疫法、时间分辨免疫荧光检测、免疫胶体金技术等进行了不同程度的探索实验,取得了一些有价值的实验数据。