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食管癌（esophageal carcinoma,EC）是世界常见的恶性肿瘤之一,食管鳞状细胞癌（esophageal squmous cell carcinoma,ESCC）是最常见的 EC 类型,大部分 ESCC 患者在确诊时已处于中晚期阶段,5年生存率仅为15%-25%。针对中晚期ESCC,放射治疗是其主要治疗方式之一,但是部分患者由于对射线低反应性而导致放疗失败。即使是相同病理类型且处于相同阶段的患者对治疗的反应性也千差万别,肿瘤基因表达的异质性或是治疗反应差异性的主要原因。综上,探索ESCC早期诊断和治疗效果预测的生物标志物,开发有靶向性的治疗策略,改善患者预后是亟待解决的问题。放射治疗抵抗是ESCC局部复发和远处转移的重要因素。放射抵抗主要通过以下机制产生:肿瘤细胞再增殖、放射损伤修复、适应性血管生成、放射敏感性相关信号通路激活。寻找潜在的放射增敏靶点,设计合理的增敏剂是应对放射抵抗的重要策略。尽管放射增敏研究取得了一定的进展,但是由于欠缺针对特定靶点的放射增敏剂,可获益人群得不到有效筛选,仍不能显著改善临床放射抵抗的现状。能量代谢重编程是肿瘤的基本特征之一,细胞代谢是驱动肿瘤生存、进展、耐药、免疫逃逸以及复发的关键,已有众多研究证实通过靶向细胞代谢可以提高治疗耐受肿瘤的治疗反应性。放射线照射肿瘤组织时不仅可以引起大量细胞因子的分泌并引起相关信号通路改变,导致肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）发生变化,同时还可以改变细胞的代谢,并以此应对放射线所造成的损伤参与放射抵抗,但是具体机制尚不清晰。花生四烯酸（arachidonic acid,AA）是一种广泛分布于哺乳动物细胞膜的长链多不饱和脂肪酸。脂氧合酶（lipoxygenase,LOX）途径是AA代谢的主要途径。人LOX主要有5-LOX、12-LOX和15-LOX,可分别催化AA形成 5-羟基二十碳四烯酸（hydroxyeicosatetraenoic acid,HETE）、12-HETE、15-HETE,并进一步转化为白三烯类和脂氧素类。LOX及其代谢产物HETE参与多种生理病理过程,包括炎症和肿瘤,近年来12-LOX和12-HETE越来越受人们关注。经TCGA数据库检索,我们发现ESCC肿瘤组织中的12-LOX的表达明显高于癌旁,但12-LOX在ESCC发生发展及治疗过程中发挥怎样的作用,是否可产生以此为靶点的治疗方案尚不清楚。基于肿瘤细胞代谢与肿瘤进展和放射治疗反应性密切相关,本课题落脚于AA代谢相关蛋白12-LOX,探究其是否可作为ESCC潜在的预后和疗效预测靶点,进一步探寻放射增敏的新策略。本课题分为两部分,分别研究12-LOX在ESCC进展以及放射治疗中的作用,将为肿瘤细胞代谢对ESCC的影响提供新的见解,为ESCC患者提供新的疗效预测和增敏靶点。第一部分 12-LOX促进食管鳞状细胞癌恶性表型及机制目的1.研究12-LOX在ESCC恶性表型中的作用及机制;2.研究12-LOX能否作为ESCC患者的预后预测标志物;3.研究RAD001抑制ESCC恶性表型的有效性。方法1、数据库检索:TCGA数据库获取5/12/15-LOX泛癌中的表达情况、12-LOX在食管癌中的表达情况、ESCC中12-LOX表达与各临床特征之间的关系、生存曲线。2、临床数据和标本收集:收集手术切除的ESCC患者原发肿瘤组织,免疫组化（immunohistochemistry,IHC）评估12-LOX的表达;卡方检验检测12-LOX表达与各临床特征之间的关系;Kaplan-Meier法和log-rank分析绘制生存曲线,评估12-LOX表达对总生存期（overrall survival,OS）和无进展生存期（progression-free survival,PFS）的影响;ROC曲线和曲线下面积（area under the ROC curve,AUC）评价12-LOX对OS和PFS的预测价值;使用基于Cox比例风险模型的单因素和多因素分析评估12-LOX能否作为ESCC患者的预后预测因子。3、慢病毒载体构建12-LOX过表达稳转株:12-LOX过表达载体或对照载体感染ESCC细胞,嘌呤霉素（3 μg/mL）筛选,建立稳定表达12-LOX的细胞株。4、检测12-LOX对ESCC细胞增殖的影响:利用EdU细胞增殖实验、克隆形成实验和细胞增殖—毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK8）检测各组细胞的增殖能力。5、检测12-LOX对血管生成的影响:PCRArray检测各组细胞血管生成相关基因的表达情况;酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA）和 Western Blot验证相关因子的分泌和蛋白表达情况;Transwell实验和划痕实验检测人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）的迁移能力,小管形成实验检测成管能力。6、检测12-LOX促进ESCC恶性表型的分子机制:磷酸激酶抗体阵列分析各组细胞磷酸激酶的表达差异,筛选通路;Western Blot和IHC染色验证通路的激活情况。7、建立ESCC裸鼠皮下移植瘤模型:构建LV-Ctrl或LV-12-LOX裸鼠皮下移植瘤模型,计算肿瘤体积并绘制生长曲线,研究12-LOX对移植瘤生长的影响;Western Blot和IHC验证通路的激活情况;免疫荧光染色（Immunofluorescence,IF）检测移植瘤12-LOX以及血管内皮标志物CD31的表达情况,研究12-LOX对移植瘤血管生成的影响。结果1、12-LOX在ESCC高表达且与不良预后有关:TCGA数据库显示,12-LOX在ESCC组织表达明显高于正常食管上皮和食管腺癌,且与肿瘤组织学类型、T分期、N分期和组织学分级显著相关,12-LOX高表达组与低表达组患者生存期存在显著差异。ESCC患者肿瘤组织切片IHC染色结果显示,患者之间12-LOX的表达存在差异,按照着色强度和阳性细胞数评分,高表达组112例,低表达组41例;卡方分析表明12-LOX表达与T分期、N分期存在显著相关性,Kaplan-Meier曲线显示12-LOX低表达组患者有更好的OS和PFS,单因素和多因素分析显示12-LOX可作为ESCC患者的预后预测因子。2、12-LOX促进ESCC细胞的增殖:相比于对照组,12-LOX过表达组ESCC细胞的增殖能力更强,12-LOX特异性抑制剂Baicalein抑制细胞的增殖。3、12-LOX促进ESCC肿瘤血管生成:相比于对照组,12-LOX过表达组肿瘤细胞的VEGF、IL-6和IL-8等促血管生成因子的mRNA表达更高;相比于对照组,12-LOX过表达组肿瘤细胞上清显著增强HUVECs的迁移能力和小管形成能力。4、12-LOX过表达组PI3K/AKT/mTOR通路激活:12-LOX过表达组ESCC细胞PI3K/AKT/mTOR通路显著激活;12-LOX过表达裸鼠移植瘤和12-LOX高表达ESCC患者PI3K/AKT/mTOR通路显著激活。5、12-LOX通过激活PI3K/AKT/mTOR通路发挥促肿瘤作用:PI3K抑制剂LY294002刺激组ESCC细胞增殖能力和VEGF表达分泌相对于12-LOX过表达组显著降低,LY294002可以逆转12-LOX发挥的促肿瘤作用。6、RAD001在体外抑制12-LOX促进的ESCC细胞增殖和血管生成:mTOR抑制剂RAD001刺激组ESCC细胞增殖能力相对于12-LOX过表达组显著降低;RAD001抑制HUVECs的迁移,相比于12-LOX过表达组,RAD001+12-LOX过表达组肿瘤细胞上清HUVECs的小管形成能力降低。7、12-LOX体内发挥促肿瘤作用:相比于对照组,12-LOX过表达组移植瘤的生长速度更快,体积和重量更大;12-LOX过表达组血管内皮标志物CD31表达高于对照组,12-LOX在体内促进裸鼠移植瘤的生长和肿瘤血管生成。8、RAD001体内抑制12-LOX发挥的促肿瘤作用:RAD001+12-LOX过表达组裸鼠移植瘤的生长速度和体积低于12-LOX过表达组,CD31表达低于12-LOX过表达组,RAD001在体内抑制12-LOX发挥的促ESCC细胞增殖和肿瘤血管生成作用。结论1、12-LOX在ESCC组织高表达,与ESCC患者不良预后相关,或可作为ESCC患者的预后预测标志物;2、12-LOX通过激活mTOR通路发挥促进ESCC细胞增殖和肿瘤血管生成的作用;3、12-LOX是ESCC患者潜在的治疗靶点,RAD001或可成为12-LOX高表达患者有效的治疗策略。第二部分 12-LOX在食管鳞状细胞癌放射抵抗中的作用目的1、研究12-LOX在ESCC放射抵抗中的作用;2、研究12-LOX能否作为单纯放疗ESCC患者疗效预测指标;3、探究Baicalein作为放射增敏剂的有效性和潜在机制。方法1、建立放射抵抗细胞株（radioresistant Eca109,rEca109）:Eca109 细胞生长至 30%-50%融合度时2GyX射线照射,密度达80%-100%进行传代,培养至良好状态再次照射,直至累计照射剂量达到60Gy（2Gy×30）,10Gy大剂量照射后扩增存活的细胞克隆。2、验证放射抵抗株rEca109:rECa109细胞0/2/4/6/8Gy梯度照射,基于克隆形成实验绘制细胞存活分数曲线并计算平均致死剂量（mean lethal dose,D0）和准阈剂量（quasi-threshold,Dq）;构建Eca109和rEca109裸鼠移植瘤模型,测量计算移植瘤体积,绘制时间一体积曲线,比较两组照射后移植瘤的生长速度和体积大小。3、检测12-LOX和12-HETE对ESCC放射敏感性的影响:对于各处理组细胞,利用克隆形成实验评价细胞存活能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,评价各组细胞对X射线的敏感性。4、探究12-LOX影响放射敏感性的潜在机制:利用TCGA数据库检索12-LOX与DNA损伤修复（DNA damage response,DDR）通路关键基因的表达相关性;利用DNA损伤修复PCR Array检测12-LOX过表达组与对照组ESCC细胞DDR通路关键基因表达的差异性。5、稳定表达12-LOX shRNA放射抵抗细胞系的构建:向rEca1 09细胞转染表达12-LOX shRNA（sh-12-LOX）的质粒,嘌呤霉素筛选获得表达sh-12-LOX的稳转株。6、检测敲降12-LOX对放射抵抗细胞株rEca109放射敏感性的影响:对于各处理组细胞,利用克隆形成实验评价细胞存活能力;流式细胞术检测细胞的凋亡情况;评价12-LOX对放射敏感性的影响。7、检测12-LOX选择性抑制剂Baicalein对ESCC放射敏感性的影响:Eca109细胞照射前Baicalein预刺激,对于各处理组细胞,利用克隆形成实验和流式细胞术检测细胞的存活情况和凋亡情况,评价各组细胞对X射线的敏感性。8、检测Baicalein联合放疗对DNA损伤的影响:Eca109细胞照射前Baicalein预刺激,免疫荧光染色检测各组DNA损伤指标γ-H2AX的表达情况,比较DNA损伤程度的差异。9、探究Baicalein影响ESCC放射敏感性的潜在机制:肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）PCR Array检测Baicalein刺激组与对照组肿瘤干细胞相关基因表达的差异性,检测Baicalein对ESCC肿瘤干细胞的影响。10、临床标本的数据收集:收集不能耐受化疗从而选择单纯放疗的晚期ESCC患者治疗前的活检病理标本及临床病例资料。免疫组化评价12-LOX的表达;卡方检验计算P值,检测ESCC患者治疗3个月后放疗反应与12-LOX表达的相关性;Kaplan-Meier曲线评估12-LOX对OS和PFS的影响。结果1、放射抵抗细胞株rEca109建成:梯度剂量的X线照射下,rEca109的存活分数、D0、Dq显著高于Eca109;rEca109照射组移植瘤生长速度和体积显著高于Eca109照射组;以上均提示抵抗株rEca109具有放射抵抗性。2、12-LOX和12-HETE增加ESCC细胞放射抵抗:6Gy照射时,12-LOX过表达组与12-HETE刺激组的克隆形成数显著多于对照射组,Annexin V阳性细胞率显著低于对照组,说明12-LOX和12-HETE可以促进ESCC细胞的存活,参与放射抵抗。3、下调12-LOX增加放射抵抗株rEca109的放射敏感性:6Gy照射时,sh-12-LOX-rEca109组的克隆形成数显著低于rEca109照射组,Annexin V阳性细胞率显著高于rEca109照射组,以上结果均说明敲降12-LOX可以削弱抵抗株rEca109对X射线的抵抗。4、12-LOX与多种DDR通路基因地表达相关:TCGA数据库检索结果显示,12-LOX与多种DDR关键基因的表达存在相关性,其中涉及到DNA损伤修复相关基因、细胞周期相关基因、细胞凋亡相关基因以及ATM/ATR通路相关基因等。5、过表达12-LOX导致多种DDR通路基因表达变化:ESCC细胞12-LOX过表达后多种DDR相关基因表达发生变化,RAD9A、CDC25A、BBC3、XRCC3、GADD45A等基因mRNA显著升高,RAD1、CDC25C、ATRX等显著降低,提示12-LOX在ESCC细胞中显著影响DNA损伤修复基因的表达。6、Baicalein联合放疗降低ESCC细胞的存活:放射联合Baicalein组Annexin V阳性细胞率显著高于单纯照射组,克隆形成数显著少于单纯照射组,以上结果均提示Baicalein对ESCC起放射增敏作用,或可成为放射增敏剂。7、Baicalein联合放疗增加ESCC细胞DNA损伤:免疫荧光染色显示放射联合Baicalein组γ-H2AX表达更高,DNA损伤程度更高,提示Baicalein可以增加X射线造成的DNA损伤。8、Baicalein影响放射抵抗株多种肿瘤干细胞相关基因的表达:Baicalein刺激后多种CSCs相关基因表达发生变化,差异基因主要富集在Notch通路,提示Baicalein可能通过Notch通路影响放射抵抗株的干细胞特性。9、12-LOX影响单纯放疗ESCC患者疗效和生存:12-LOX低表达组的疾病控制率（Disease Control Rate,DCR）显著高于12-LOX高表达组,且有更好的OS和PFS。结论1、X射线照射促进ESCC细胞12-LOX的表达水平,12-LOX和12-HETE与ESCC细胞放射抵抗相关;2、12-LOX与单纯放疗ESCC患者的放疗反应密切相关,或可成为潜在的放射增敏靶点;3、Baicalein联合放疗增加放射线导致的ESCC细胞DNA损伤,或可作为放射增敏剂。