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前言锰（Manganese,Mn）是一种重要的环境和工业污染物,人们在生活中长期低浓度接触锰所引起的慢性蓄积性中毒日益受到关注。脑是锰毒作用的主要靶器官,锰可以通过血脑屏障,主要在黑质纹状体多巴胺能神经元中蓄积,导致神经系统退行性病变,职业工人长期接触锰,可出现类似帕金森病的临床表现。研究表明锰的毒性机制与线粒体的结构和功能异常有关,锰能引起能量代谢障碍,使ATP含量下降;通过对线粒体结构和功能损伤,引起细胞凋亡。锰对线粒体具有特殊的亲和力,它可蓄积于富含线粒体的组织中,锰从线粒体清除的速率慢,然而关于锰对线粒体功能的影响报道较少,且线粒体功能的改变在锰中毒中的作用仍不清楚。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）,是谷胱甘肽的前体,是一种含有巯基的化合物,近年来发现NAC作为抗氧化剂,是良好的脑保护剂。本实验通过线粒体孵育液和整体动物大鼠染锰两种方式研究锰对脑线粒体内GSH、MDA含量产生和大鼠脑线粒体能量代谢过程中顺乌头酸酶、线粒体复合体I活性及线粒体膜电位的影响,探讨脑线粒体功能的损害在锰早期毒性作用中的意义,并用NAC干预锰的上述影响,为锰中毒早期诊断、早期治疗提供科学依据。材料与方法体外线粒体孵育液染锰实验:由中国医科大学实验动物中心提供实验用Wistar大鼠20只,体重（180±10）g,实验前适应性饲养7d。大鼠麻醉后断头取脑,梯度离心得线粒体液。将所得线粒体液分为6组,第1组为对照组;第2～5组为不同剂量染锰组,分别加入5、50、500、1000μmol/L MnCl2;第6组为NAC预处理组,线粒体液先用500μmol/L NAC预处理1h后加500gmol/L MnCl2。各组于培养箱内30℃孵育2h后测MDA、GSH含量和顺乌头酸酶、线粒体复合体I的活性及线粒体膜电位,每个指标设6个样本。体内实验:Wistar大鼠24只,雌雄各半,按体重随机分成3组,第1组为对照组,第2组为单纯染锰组,第3组为NAC预处理组。第1-2组腹腔注射0.9%NaCl,第3组腹腔注射1mmol/kg NAC,2h后,第1组皮下注射0.9%NaCl,第2-3组皮下注射200μmol/kg MnCl2,注射剂量均为5ml/kg,连续注射21d。最后一次注射24h后,大鼠用乙醚麻醉断头处死,切取脑纹状体和皮质,梯度离心得线粒体测量MDA、GSH含量和顺乌头酸酶、线粒体复合体I的活性及线粒体膜电位。结果体外线粒体孵育液染锰实验:与对照组相比,50、500、1000μmol/L染锰组MDA含量显著升高,500、1000μmol/L染锰组GSH含量显著降低;500、1000μmol/L染锰组顺乌头酸酶活性显著降低（P＜0.05）,50、500、1000μmol/L染锰组线粒体复合体I的活性显著降低（P＜0.05）;500、1000μmol/L染锰组线粒体膜电位显著降低（P＜0.05）。且在一定范围内随着MnCl2剂量增加,顺乌头酸酶、线粒体复合体I的活性有降低趋势,MDA含量有升高趋势,GSH含量和线粒体膜电位有降低趋势。与单纯染锰组相比,NAC预处理组MDA含量显著降低（P＜0.05）,GSH含量和线粒体膜电位显著升高（P＜0.05）,顺乌头酸酶、线粒体复合体I的活性和线粒体膜电位显著升高（P＜0.05）。体内实验:与对照组相比,单纯染锰组MDA含量显著升高,GSH含量显著降低;顺乌头酸酶、线粒体复合体I的活性显著降低;线粒体膜电位显著降低（P＜0.05）。与单纯染锰组相比,NAC预处理组MDA含量显著降低,GSH含量显著升高;顺乌头酸酶、线粒体复合体I的活性显著升高;线粒体膜电位显著升高（P＜0.05）。讨论线粒体是真核细胞中重要的细胞器,是细胞进行生物氧化和能量代谢的主要场所,也是易受外来化合物累及的位点。本研究发现,锰引起MDA含量升高,说明锰引起了脂质过氧化。由于锰是过渡金属元素,是多不饱和脂肪酸氧化的起动因子,其还能特异高效地催化脂质过氧化物的分解,引起自由基链锁反应。过量产生的自由基还可以直接攻击细胞生物大分子如蛋白、脂质及核酸等,引起细胞的氧化性损伤。本研究发现,锰可引起GSH含量降低,可能是锰产生的自由基大量的消耗GSH。研究表明GSH在黑质纹状体的水平与帕金森病症状的严重程度相关,在严重帕金森病患者中GSH水平几乎下降为零,GSH的损耗严重影响多巴胺神经元的生存。锰引起MDA含量升高,GSH含量降低,说明锰在线粒体内产生过量的自由基,引起了线粒体内抗氧化系统受损,从而导致线粒体的氧化损伤。本研究表明,体外和体内线粒体染锰都导致顺乌头酸酶活性降低,NAC预处理导致顺乌头酸酶活性升高,说明锰诱导的自由基增加也可使顺乌头酸酶活性降低。失活的顺乌头酸酶形成[3Fe-4S]+残基,同时释放等量的Fe2+和H2O2,而Fe2+和H2O2是Fenton反应的成分,他们可生成活性特别高的·OH,且Gerald S.Shadel.发现顺乌头酸酶与线粒体DNA紧密相连形成“类核体”,所以产生的·OH可以攻击线粒体DNA,引发一系列的后续损伤。本研究中MnCl2导致线粒体复合体I活性降低,NAC预处理组活性升高。线粒体复合体I的活性中心为[Fe-S]且富含巯基,锰产生的自由基可损伤线粒体复合体I的[Fe-S]基团和导致-SH交联形成S-S而使其活性降低。线粒体复合体I活性降低可阻断NADH进入呼吸链进行电子传递,导致细胞能量代谢障碍,ATP合成受阻;并且使Co-Q部位聚集的电子增多,导致电子漏流增加,自由基产生增多。本研究显示,锰可引起MMP降低,NAC预处理导致MMP升高,说明锰引起的氧化损伤特别是线粒体膜的脂质过氧化导致MMP的降低。MMP降低,将阻断线粒体氧化磷酸化,导致能量代谢障碍,ATP合成下降。且MMP降低被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前,一旦MMP崩溃,细胞凋亡不可逆转。综上所述,锰可以使线粒体内自由基含量增加,脂质过氧化增强,同时损伤线粒体内的抗氧化系统,导致氧化损伤;使线粒体能量代谢障碍,ATP生成减少;使MMP降低,进而引发线粒体损伤,导致细胞凋亡,这可能是锰神经毒作用的重要途径。NAC预处理能有效预防锰所致大鼠脑线粒体氧化损伤和能量代谢降低,对线粒体有很好的保护作用。结论1、线粒体孵育液染锰和给予大鼠低剂量长期染锰,可引起大鼠脑MDA和GSH含量下降,且在线粒体孵育液染锰实验部分锰可以剂量依赖性地诱导大鼠脑MDA和GSH含量降低,说明锰可导致大鼠脑线粒体氧化损伤。2、线粒体孵育液染锰和给予大鼠低剂量长期染锰,可引起大鼠脑顺乌头酸酶和线粒体复合体I活性下降,且在线粒体孵育液染锰实验部分锰可以剂量依赖性地诱导大鼠脑顺乌头酸酶和线粒体复合体I活性下降,说明锰可导致大鼠脑线粒体能量代谢障碍。3、NAC预处理能有效预防线粒体孵育液染锰和大鼠低剂量长期染锰所致大鼠脑线粒体氧化损伤和能量代谢障碍。