研究背景和目的黑斑息肉综合征（Peutz-Jeghers Syndrome,PJS,OMIM#175200）是一种临床少见的常染色体显性遗传病,主要临床表现为皮肤黏膜黑色素沉着、胃肠道多发错构瘤性息肉以及多个器官恶性肿瘤高度易感性,其临床发病率约在1/120000-1/8300之间。现已证实STK11为PJS主要致病基因;高达94%的PJS患者可检测到STK11基因突变,突变类型以点突变、小片段插入或缺失为主,也可有整个外显子或基因的缺失;该类患者的肿瘤发生率是普通人群的10-18倍,其家族的癌症发病率也较普通人群为高。目前尚无干预措施根治和预防PJS发病及息肉恶变。因此,PJS作为一种中等度癌变风险的遗传性大肠癌综合征,癌变缓慢;研究其相关致病基因、息肉发生及恶变的途径和机制具有非常重要的理论和现实意义。STK11（serine/threonine kinase 11）作为抑癌基因,其编码一种包含433个氨基酸的丝氨酸/苏氨酸激酶,是迄今为止发现的唯一的具有抑癌作用的激酶。其中第49-309位氨基酸具有催化活性的激酶区。STK11单体位于胞核无生物活性,只有当假激酶样衔接蛋白STRADα（STE20 related adaptor protein）与其形成复合体后,可促进后者从细胞核内移位到细胞浆内;脚手架蛋白MOD25α（mouse protein 25）蛋白与STRAD羧基端结合,增加了 STK11-STRAD复合物在细胞浆中的空间定位和构象,使STK11的激酶活性提高。STK11蛋白通过磷酸化底物蛋白或者与靶蛋白结合,调节基因表达,调控其在细胞周期G1期阻滞,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,染色质重构,细胞极性诱导,胚胎血管发育以及能量代谢的应答调控等方面发挥重要作用。当STK11基因突变导致其蛋白功能异常,从而失去对细胞生长的控制,增加癌症的风险的可能。因此,STK11基因作为起普遍作用的肿瘤抑制基因,在散发性肿瘤以及PJS相关的肿瘤发生、发展过程中发挥的重要作用,愈来愈受到人们的重视。腺苷酸依赖的蛋白激酶（AMP activated protein kinase,AMPK）是 STK11的最适的底物,在STK11信号通路中发挥重要作用。研究表明STK11通过直接磷酸化并激活底物AMPK,实现对mTOR信号通路的负向调控,减少蛋白合成,抑制细胞增殖生长;STK11/AMPK信号途径可诱导细胞周期阻滞,也可诱导半胱天冬酶依赖的细胞凋亡和造血系统肿瘤细胞自噬。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶。在mTOR信号通路中,包括细胞内能量缺乏、缺氧、促有丝分裂原甚至生长因子等各种细胞信号均能影响mTOR信号通路产生变化;主要通过控制蛋白质的合成,调节并参与细胞生长、增殖、细胞周期进展、凋亡过程以及肿瘤新血管形成及转移;因而在肿瘤的发生、发展过程中起着至关重要的作用。p70S6K1（p 70 ribosomal protein S6 kinases）和 4E-BP1（4E-binding protein-1）是 mTORC1 经典的下游分子靶蛋白。mTOR介导的p70S6K1（Thr389）和4EBP1（Thr37/46）磷酸化水平的提高,提高mRNA的翻译效率,加速蛋白质的合成,进而促进细胞增殖。有研究证实,在肿瘤细胞中STK11蛋白发生改变,无法对下游底物的AMPK磷酸化和激活,从而对mTOR信号通路抑制作用丢失,使得mTOR信号及其介导的下游靶蛋白p70S6K1和4E-BP1的异常磷酸化激活,从而加速核糖体以及蛋白质的合成,促进细胞增殖,促进肿瘤细胞的侵袭和转移、促进细胞周期进展,促进肿瘤血管的生成,从而导致肿瘤的发生发展。大量的前期研究也阐述了STK11-AMPK-TSC2通过下调mTORC1活性从而达到抑制细胞生长的作用。近年来,AMPK/mTOR及其下游信号分子p70S6K1和4E-BP1在肿瘤发生发展中的作用成为肿瘤研究领域的热点。综上所述,本研究中通过收集在2013年至2015年期间,我院确诊的来自11个家系的21例PJS患者及其亲属的外周血液及相应的息肉标本,应用DNA全基因组直接测序法联合MLPA（多重连接探针扩增技术）对收集的样本进行STK11基因突变检测,明确PJS患者的致病因素以及发现该基因可能存在的新突变位点,丰富STK11的基因突变谱。此外,为了探索最新发现的STK11基因的错义突变（c.869T>C和c.88G>A）对其编码蛋白功能的影响,筛选并构建了pGCMV-GFP-STK11（WT）、STK11 基 因 新突变 型表达质 粒pGCMV-GFP-STK1 1-c.869T>C 和 pGCMV-GFP-STK1 1-c.88G>A 及空白对照载体质粒pGCMV-GFP-Vector（Empty）,分别转染STK11表达缺失的HeLa细胞和SW1116细胞后验证细胞内STK11 mRNA及其蛋白的表达,分析新发现的STK11错义突变对细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移和侵袭等生理活动,以及调控STK11-AMPK-mTOR信号通路下游靶蛋白磷酸化表达的影响,明确STK11错义突变对其编码蛋白功能的影响及是否为致病突变,为临床遗传咨询及产前诊断提供科学依据。同时深入探讨STK11基因突变所致PJS发病及其息肉发生发展和恶性变可能相关的信号通路和识别潜在的分子治疗靶点,为化学药物干预治疗奠定了良好的理论基础。材料和方法1.研究对象及样本采集收集2012年1月至2015年10月期间于南方医院消化科、普外科就诊住院的PJS患者,以及全国各地自发联系到我们消化科或实验室的PJS患者。对每个PJS先证者进行家系调查、采集临床资料,登记并绘制PJS家系遗传图谱。一方面抽取PJS患者及其家属外周静脉血6ml置于含有EDTA抗凝管中,2ml置于非抗凝管中。按要求离心、分装、按顺序编号后存放于-80度低温冰箱,同时收集PJS患者息肉组织及配对正常组织（距息肉边界5厘米以上）,将新鲜组织切小块分装至冻存管中,按序编号后-80℃低温冰箱保存;以供后续实验使用。将新鲜组织均经常规10%中性福尔马林溶液固定,石蜡包埋,3-4um连续切片,分别进行HE染色和免疫组化染色。本课题取得患者及其家属知情同意后,签署知情同意书,并且经南方医科大学南方医院伦理道德委员会的许可。2.STK11引物设计利用NCBI基因数据库查找STK11基因的全长编码序列。参考文献直接引用文献引物序列及用Primer3.0在线软件自行设计扩增STK11基因的引物,并摸索引物反应条件。3.PJS患者STK11基因胚系突变检测应用前期收集保存的来自11个家系的21位PJS患者及其家属的血液、息肉标本,同时收集南方医院体检中心50位健康人血液作为正常对照组。提取PJS先证者血液基因组DNA,PCR扩增后纯化回收产物,通过DNA直接测序法检测STK11基因的胚系突变,利用HGMD、NCBI数据库在线BLAST比对进行初步筛查后,突变者基因分别与其家系健康人及正常对照组DNA序列比较,并参考NCBI、dbSNP数据库,排除单核苷酸多态性可能（SNP）。对于DNA直接测序法未能检测出突变者,采用MLPA技术进行基因大片段缺失或重复检测,利用Gene Marker（?）HID STR Human Identity Software 分析结果。4.STK11质粒的构建及鉴定将STK11基因突变的编码序列与载体连接,经筛选克隆鉴定构建了空载体质粒 pGCMV-GFP-Vecor（Empty）、野生型质粒 pGCMV-GFP-STK11（WT）及突变型质粒 pGCMV-GFP-STK11（c.869T>C）和突变型质粒 pGCMV-GFP-STK11（c.88G>A）,委托上海吉玛生物技术有限责任公司。5.细胞培养人结肠癌细胞株 SW1116,HT29,SW620,SW480,Lovo,Caco2 和 Hct116;人宫颈癌细胞株HeLa;正常胃粘膜上皮细胞GES-1;人胚肾上皮细胞HK-293T;采用含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗DMEM培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下传代培养。采用对数期生长的细胞用于实验。6.细胞转染提前18～24h将需要转染的细胞株接种于6孔板中（2×105/孔）。按LipofectamineTM 3000试剂说明书操作进行,取适量重组STK11表达质粒（Empty、WT、c.869T>C和c.88G>A）转染到野生型STK11缺失的细胞中,37℃含5%C02的湿润的孵箱中孵育,转染48h后收细胞进行后续实验。7.荧光实时定量 PCR（real-time PCR）细胞转染四种STK11重组质粒24-48h后,使用Trizol裂解提取总RNA,经逆转录成cDNA后,采用Sybrgreen法进行实时荧光定量PCR方法检测STK11 mRNA表达水平,通过相对定量以2-△△Ct值代表基因的相对表达强度。所有步骤均参照说明书。8.免疫组化将石蜡切片进行脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、抗体孵育、DAB显色、复染、透明、封片等步骤进行,孵育p-S6（Ser240/244）（1:400）抗体,4℃过夜。免疫组化的检测结果进行半定量检测p-S6蛋白表达;随机选取5个高倍视野,如果核阳性的肿瘤细胞数超过50%,则认为该样本阳性。9.Western blot细胞铺于6孔板内,瞬时转染HeLa、SW1116细胞,转染48小时并饥饿12小时后RIPABuffer（已加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）裂解细胞,抽提细胞总蛋白;采用BCA法进行蛋白浓度测定,然后10%SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、化学发光法显影。检测并比较不同转染组细胞中STK11-AMPK-mTOR信号通路蛋白的表达水平。10.细胞生物学实验[1]CCK-8细胞增殖实验 将1×103个细胞接种于96孔板中,每孔体积200μl,每组5孔,同时设空白对照,分别培养24h、48h、72h和96h。每孔加入CCK-8溶液10μ1,37℃孵育2h后终止孵育,以空白对照孔调零,酶标仪上450nm测定各孔吸光度值（OD值）,以相对应OD 比值表示细胞增殖能力大小。[2]平板克隆形成实验 接种800个细胞到6孔板中,保证细胞分散均匀,培养2周。出现肉眼可见的细胞克隆时,终止培养,弃去培养基,多聚甲醛固定后结晶紫染色,显微镜下计数形成的克隆数（≥50个细胞为一个克隆）。平板克隆形成率=形成克隆数/接种细胞数×100%。[3]细胞周期检测 采用碘化丙锭（propidiumiodide,PI）单染法检测细胞周期分布。将细胞固定、Rnase A消化、PI染色后,流式细胞仪检测。[4]细胞凋亡检测 采用Annexin V-APC/7-AAD凋亡试剂盒检测细胞转染不同STK11重组质粒的细胞的凋亡率,按照说明书操作进行。4℃,避光,加入5ul APC 和 5ul AAD 溶液,温柔摇匀细胞;15min 后加入 400ul 1*BindingBuffer混匀,行流式细胞检测,并比较不同组细胞凋亡率的差异。[5]细胞迁移实验 将细胞重悬于无血清的DMEM培养基中,每个Transwell小室中加入细胞,培养板每孔加入10%胎牛血清培养基,培养24h-48h后取出Transwell小室,固定结晶紫染色显微镜下观察穿过膜的细胞。[6]细胞侵袭实验 Matrigel基质胶冻融后,向Transwell小室中均匀加入50ul,37℃培育12h后,余操作同细胞迁移实验。11.统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析,实验中涉及到两组数据之间的比较均采用两独立样本的t检验,而三组或三组以上数据的比较采用单因素方差分析,方差齐性时,采用ANOVA,其多重比较采用LSD法;方差不齐时采用近似F检验Welch法,多重比较采用Dunnett T3。P<0.05为差异有统计学意义（*P<0.05,**P<0.01,and***P<0.001）。结果1.DNA直接测序联合MLPA技术检测STK11基因编码区序列我们收集已确诊的来自11个家系的21例PJS患者及其亲属的外周血及相应的息肉标本,联合应用Sanger测序和MLPA检测技术进行STK11基因突变检测,我们共发现8个家系发生STK11基因突变或者是大片段的缺失,突变率为72.7%（8/11）,而且1种截断突变和2种错义突变为首次报道突变。Sanger测序发现6种不同的突变,包括4种截断突变和2种错义突变;其中,4种突变来自家族性PJS患者中（4/5,80%）,2种在散发性家系中发现（2/6,33.3%）,有3种突变与PJS患者及其直系的亲人中发现的结肠癌、食管癌相关（3/6,50%）。此外,在5个应用DNA直接测序未能发现基因突变的PJS家系中,联合应用MLPA检测结果发现,有2个样本分别发生STK11基因第1号外显子和第3号外显子的大片段缺失;其中在1例出现基因大片段缺失的PJS患者的直系亲属中发现乳腺恶性肿瘤。由此提示STK11基因的改变与PJS的发生有关,STK11基因改变可能引起编码蛋白表达和功能的异常,明显提高与PJS相关的肿瘤的发生发展风险。2、STK11基因新突变序列分析本课题在对收集的PJS样本进行STK11基因突变检测,通过查询SNP基因库中及Clinwar数据库,我们发现有2例错义突变（c.869T>C,c.88G>A）为最新的突变（图1-5）,且至今未有文献报道过。STK11基因错义突变c.869T>C（p.Leu290Pro）为新突变,显示该基因第7号外显子的第869位碱基胸腺嘧啶T（Thymine）置换成胞嘧啶C（Cytimidine）,编码STK11蛋白的第290位密码子由ATC变成AGC,氨基酸的序列位置未发生变化,而氨基酸种类由亮氨酸（Leu）变成脯氨酸（Pro）,引起错义突变;经基因转录后翻译合成特定结构的蛋白质。由于STK11基因单碱基置换发生于氨基酸残基序列290位置,其属于蛋白激酶的活性催化区域;同时,应用工具PolyPheI12（PolyPhen2:http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）,预测 c.869T>C（p.Leu290Pro）错义突变的破坏性,得到高分数值,提示该突变编码的蛋白分子量未发生缺失,存在蛋白质激酶的活性及其功能缺失或者低下的可能。另一个新发现的STK11基因错义突变c.88G>A（p.Asp30Asn）,该基因第1号外显子的第88位碱基鸟嘌呤G（Guanine）置换成腺嘌呤A（Adenine）,编码STK11蛋白激酶的第30位密码子由ATC变成AGC,氨基酸的序列位置未发生变化,而氨基酸种类由极性带负电荷的天冬氨酸（Asp）替换为极性不带电荷的天冬酰胺（Asn）,引起错义突变;经基因转录后翻译合成特定结构的蛋白质。由于维持其激酶活性所必须的为第43-309个氨基酸,而STK11基因单碱基置换发生于氨基酸残基序列30位置,该突变位于STK11基因核信号定位的N-端非催化结构域,经基因的转录和翻译,STK11单体有可能不与STRADα、MOD25a结合形成完整的复合物,或者形成无活性不能发挥正常的生理功能的异源三聚体复合物;推测影响蛋白质翻译后修饰以及异源三聚体复合物空间定位合成等方面;同时,应用工具PolyPheI12（PolyPhen2:http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）,预测 c.88G>A（p.Asp30Asn）错义突变的破坏性,得到高分数值,提示该新的错义突变有可能导致编码的蛋白质激酶的活性以及蛋白激酶的功能缺失或者低下。另外在DNA直接测序发现的4例截断突变中,我们也发现1例新突变,即:c.143₁44insA（p.Try49Valfs*114）;插入突变c.143₁44insA,提示在STK11基因第1号外显子的第143位碱基与第144位碱基之间插入一个腺嘌呤A（Adenine）后形成终止密码子,导致截短突变的发生,促使基因转录后蛋白质翻译提前终止,致使后序氨基酸残基序列及其种类发生改变。即:由编码的位于氨基酸序列49的色氨酸突变成位于氨基酸序列1 14的缬氨酸,形成一个含有异常序列表达未完全的蛋白质,合成截短蛋白。蛋白质空间结构发生改变,最终导致蛋白的激酶活性完全丧失;STK11蛋白表达水平降低甚至丧失,无法发挥正常的生理功能,最终导致PJS相关的恶性肿瘤发生发展。3、STK11错义突变c.869T>C和c.88G>A使p-S6蛋白表达增加为了进一步探索本次研究中新发现的两种错义突变c.869T>C、c.88G>A是否影响STK11的功能。我们将含有错义突变的PJS患者及其家属的息肉组织制作成蜡块,观察STK11错义突变调控mTOR信号通路的关键下游靶蛋白p-S6（Ser240/244）磷酸化表达的影响。我们发现,p-S6蛋白在4F家系的PJS先证者（1I:3）的PJS息肉组织及5F家系的PJS先证者母亲的乳腺组织中均有表达,其中,STK11错义突变c.869T>C,p-S6蛋白的阳性染色呈棕黄色或棕褐色颗粒点状性分布于PJS息肉肠粘膜腺上皮细胞的胞核;同时没有发生STK11突变的家系健康人（Ⅱ:2）作对照,其正常肠粘膜组织中未见到p-S6蛋白阳性染色。而STK11错义突变c.88G>A,p-S6蛋白的阳性染色呈棕黄色或棕褐色颗粒点状性分布于乳腺组织导管腺上皮细胞的细胞核,同时以没有发现STK11突变的PJS患者家系的乳腺增生患者作对照,其乳腺增生的组织中未见到p-S6蛋白阳性染色。结果提示,我们新发现的STK11基因错义突变与mTOR信号通路的关键靶蛋白S6的异常磷酸化表达相关,STK11基因作为具有抑癌作用的苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶,STK11蛋白的功能缺失或者低下失去对下游通路mTOR信号途径的负性调控,P-S6蛋白表达增加,蛋白质合成增多,细胞增殖增加,从而有利于PJS的发生及PJS相关的肿瘤的发生发展。4、STK11错义突变（c.869T>C、c.88G>A）对HeLa细胞和SW1116细胞生物学特性的影响选取STK11基因表达缺失的HeLa细胞和SW1116细胞作为细胞学模型,研究两种新发现STK11基因错义突变（c.869T>C、c.88G>A）对肿瘤细胞生物学特性的影响。首先,瞬时转染构建的STK11-c.869T>C和STK11-c.88G>A重组质粒,分别用荧光定量q-PCR和Western blot检测STK11表达的改变,结果发现,在HeLa细胞和SW1116细胞中转染后,STK11的表达水平增加;为后续实验做准备。通过CCK-8实验和细胞周期检测观察STK11基因错义突变（c.869T>C,c.88G>A）表达改变对HeLa细胞和SW1116增殖能力的影响。CCK-8实验结果发现,与对照组相比,HeLa细胞和SW1116细胞分别转染两种重组突变质粒后,细胞的生长速度增加,而重组野生型细胞生长速度减慢,提示突变型STK11加速细胞增殖,野生型STK11抑制细胞增殖。细胞周期结果显示,在HeLa细胞中,与对照组相比,STK11基因错义突变（c.869T>C,c.88G>A）转染后使G1期细胞比例显著降低,S期细胞比例显著增高。在SW1116细胞中,与对照组相比,STK11基因错义突变转染后使G1期细胞比例显著降低,S期细胞比例显著增高,G2+M期细胞比例无显著改变。该结果表明,STK11基因错义突变（c.869T>C,c.88G>A）过表达可加快细胞周期由G1向S其过渡,加速HeLa细胞和SW1116细胞增殖。细胞凋亡率显示,与对照组相比,野生型和两种突变型STK11质粒分别转染细胞后,细胞凋亡明显增加,但与野生型相比,突变型无明显差异,说明STK11基因错义突变（c.869T>C,c.88G>A）对细胞凋亡调控无明显影响。在此结果的基础上,为了进一步研究STK11基因错义突变（c.869T>C,c.88G>A）对HeLa细胞和SW1116细胞生长调控的影响。应用平板克隆形成实验检测了 STK11基因错义突变（c.869T>C,c.88G>A）过表达对肿瘤细胞克隆形成能力的影响。结果发现,STK11基因错义突变（c.869T>C,c.88G>A）过表达有利于HeLa细胞和SW1116细胞的克隆形成。通过细胞迁移实验及细胞侵袭实验评估STK11基因错义突变（c.869T>C,c.88G>A）对HeLa细胞和SW1116细胞转移功能影响。细胞迁移实验结果显示,STK11基因错义突变（c.869T>C,c.88G>A）过表达均使HeLa细胞和SW1116细胞迁移能力提高。细胞侵袭实验发现,STK11基因错义突变（c.869T>C,c.88G>A）过表达使HeLa细胞和SW1116细胞侵袭能力均增强,差异具有统计学意义。结果表明,STK11基因错义突变（c.869T>C,c.88G>A）过表达促使肿瘤细胞株的迁移及侵袭能力。以上结果提示,STK11基因错义突变（c.869T>C,c.88G>A）与PJS发病及其息肉发展恶性变密切相关,为致病性突变。其编码的STK11蛋白激酶活性下降,影响蛋白功能,从而失去对细胞增殖抑制、细胞周期阻滞的调控,对mTOR信号通路的负向调控减弱,下游关键靶基因S6磷酸化激活,促进蛋白质合成,有利于肿瘤细胞过度增殖,最终导致肿瘤的发生。5、STK11错义突变c.869T>C、c.88G>A使AMPK-mTOR信号通路异常活化与STK11野生型相比,转染STK11错义突变c.869 T>C、c.88G>A重组质粒的细胞,AMPK蛋白的Thrl72位点磷酸化水平降低,mTOR通路下游靶蛋白P70S6K的Thr389位点和4EBP1的Thr37/46位点磷酸化水平升高,结果提示,STK11发生突变后对直接底物AMPK的磷酸化激活的能力减弱,mTOR信号异常活化,下游关键靶基因S6K1和4EBP1磷酸化激活。结论1、PJS家系发生STK11基因突变的概率为72.7%,其中家系为80%,而散发家系约33.3%,提示存在新的突变基因或者低外显率,说明PJS具有遗传异质性提示存在新的突变基因的处在或者低外显率,说明PJS具有遗传异质性。2、我们新发现 3 种 STK11 基因突变（c.143₁44insA、c.869T>C 和 c.88G>A）且均为致病性突变,丰富了 STK11基因突变谱。3、STK11错义突变c.869T>C和c.88G>A均无蛋白表达量的缺失,提示该突变可能不影响STK11基因的转录与翻译过程;4、STK11错义突变c.869T>C和c.88G>A导致编码蛋白激酶活性下降或者缺失,蛋白功能破坏,促进细胞增殖,加快细胞周期进程,对细胞凋亡无明显影响,增强细胞迁移和侵袭的能力;同时降低了 STK11对p-AMPK的激活能力;使mTOR通路异常活化,提高下游靶基因P70S6K和4EBP1磷酸化水平。5、STK11的下游信号通路mTOR可能与PJS发病及其息肉恶性变有关,mTOR通路关键靶基因P70S6K、4EBP1存在成为PJS临床根治或者靶向药物的可能。