论文部分内容阅读
真菌里氏木霉(Trichoderma reesei,T.reesei)作为生产纤维素酶的主要工业菌株,具有培养相对简单、低廉、不易染菌和发酵手段成熟等特点。里氏木霉中存在碳源代谢物阻遏效应,其纤维素酶表达涉及多种纤维素酶基因的诱导以及转录调控因子和碳源阻遏因子等正负调控作用。参与里氏木霉碳源代谢阻遏的调控蛋白包括CRE1、CRE2、CRE3和CRE4,分别与构巢曲霉等丝状真菌的CREA、CREB、CREC与CRED蛋白具有高度的同源。CRE4/CRED相关的报道极少,CRE4可能通过介导泛素连接酶从而参与纤维素酶调控。本研究首次通过siRNA干扰手段抑制里氏木霉cre4基因的表达,并构建了cre4基因过表达载体,对其参与纤维素酶表达的调控作用进行了初步研究,进而探究里氏木霉碳代谢阻遏的调控网络,研究结果如下:以cre4为靶基因设计si RNA干扰片段,并选取其中4条siRNA(T2、T7、T10和阴性对照Neg),分别构建干扰载体p-Ppdc’-T2-Tcbh1、p-Ppdc’-T7-Tcbh1、p-Ppdc’-T10-Tcbh1和p-Ppdc’-Neg-Tcbh1,并转化T.reesei QM9414原生质体中,经基因组PCR鉴定和DNA测序结果确定,筛选得到含有完整干扰表达盒的重组菌T.reesei-cre4-T2,T.reesei-cre4-T7,T.reesei-cre4-T10及阴性对照菌T.reesei-cre4-Neg。根据荧光定量PCR结果显示,相比于诱导培养24 h,培养48 h后干扰重组菌T.reesei-cre4-T2,T.reesei-cre4-T7和T.reesei-cre4-T10中cre4基因的表达水平,结果显示在三个干扰重组菌株中,cre4基因的表达量分别下降了87.0%,71.0%,80.0%,而阴性对照菌T.reesei-cre4-Neg中cre4基因的表达量和出发菌株T.reesei QM9414相近。通过测定滤纸酶活力(FPA)和羧甲基纤维素酶活力(CMCA)发现,干扰重组菌在诱导培养时酶活力均有所提高,在72 h分别达到两种酶活的最大值,干扰重组菌的FPA比出发菌株T.reesei QM9414最大高出2.0 IU/m L,CMCA比出发菌株最大高约4.0 IU/mL,其中重组菌T.reesei-cre4-T2的干扰效果最为明显。以上结果表明,干扰片段在转录水平上对cre4基因具有序列特异性干扰作用,从而导致重组菌中cre4基因表达量下调,进一步可能导致纤维素酶基因表达量上调,初步证明cre4基因的表达产物CRE4可能参与纤维素酶基因表达的负调控作用。另一方面,设计特异性引物cre4-F/cre4-R,从T.reesei QM9414基因组模板中扩增出cre4基因,克隆到经改造过的载体p-Ppdc’’-Tcbh1上得到过表达载体p-Ppdc’’-cre4-Tcbh1,转化T.reesei QM9414原生质体中,经基因组PCR鉴定筛选得到2株含有完整过表达盒的重组菌T.reesei-cre4-E5和T.reesei-cre4-E14。根据荧光定量PCR结果显示,cre4基因重组菌株T.reesei-cre4-E5和T.reesei-cre4-E14在诱导培养48 h后cre4 mRNA表达量与诱导培养24 h表达量相比分别增加4倍和5倍。通过SDS-PAGE和Western Blot结果确认,CRE4蛋白在cre4基因重组菌中实现过量表达,分子量大小约为110 kDa。通过测定滤纸酶活力和CMC酶活力,发现表达重组菌的酶活力在诱导培养的整个周期均低于出发菌株T.reesei QM9414,在诱导培养72 h时滤纸酶活力和CMC酶活力比出发菌株T.reesei QM9414分别下降0.5和0.8个活力单位。综合干扰重组菌的结果表明,CRE4在T.reesei QM9414中可能以阻遏物的形式调控T.reesei QM9414中纤维素酶的表达。为了进一步分析CRE4对整个纤维素酶表达调控系统的影响,我们使用荧光定量PCR分析代谢阻遏物基因ace1、cre1、cre2和cre3以及纤维素酶基因cbh1、egl1和木聚糖酶激活因子XYR1在干扰重组菌和cre4基因重组菌中的表达量。实验结果显示,CRE4对阻遏物ACE1、CRE2、CRE3和激活因子XYR1无明显的调控作用,而干扰cre4基因引起cre1在转录水平上下降了约50.0%,说明CRE4对cre1产生正调控作用。另一方面,纤维素酶基因cbh1和egl1在干扰重组菌中的表达量均有所增加,为出发菌株的2倍左右,说明干扰cre4基因可以部分解除阻遏物对纤维素酶基因表达的抑制。本文通过利用siRNA干扰技术和构建CRE4过表达载体研究了cre4基因对纤维素酶表达的调控作用,证实在T.reesei QM9414中CRE4以阻遏物的形式调控纤维素酶的表达。该实验结果对于阐明里氏木霉合成纤维素酶的促进、阻遏的调控机制和提高里氏木霉产纤维素酶的表达水平提供了实验依据。