近年来,随着交通运输业的迅速发展和人民生活水平的不断提高,机动车和拥有驾驶执照的人员数量快速增长,交通事故频繁发生,其中因驾驶人员饮酒与醉酒造成的交通事故就占20%。长期以来,由于我国一直没有检测酒后(饮酒8小时之内)驾车的国家标准,又没有一种简便、快速、准确检测血酒精浓度的便携式检测仪。因此当酒后驾车人员面临交通警察处罚时,还“理直气壮”地要法律条例,处罚证据。目前血酒精浓度(blood alcohol concentration,BAC)测定的主要方法有:呼气法、分光光度法、气相色谱法。呼气法虽然操作简单、价格低廉,但只能定性,不能准确定量检测。分光光度法和气相色谱法均需要血浆或血清样本,受试者要到医院或专业机构抽取静脉血,给受试者及交管部门带来极大不便。综上所述,呼气法、分光光度法、气相色谱法不能满足简便、快速定量检测血酒精浓度的要求。生物传感器是分析生物技术的一个重要领域,它是一个典型的多学科交叉产物,结合了生命科学、分析化学、物理学和信息科学及其相关技术,能够对所需要检测的物质进行快速分析和追踪。经过30多年的发展,已经成为一个涉及内容广泛、多学科介入和交叉、充满创新活力的领域。生物传感器由于其高选择性、高灵敏度,已经被广泛地应用于临床诊断、食品工业、环境监测等领域。以酶作为分子识别器件的电化学生物传感器称为酶电极。酶电极是由一个固定化的酶敏感膜和与之密切结合的电极组成的换能系统,它把固化酶和电极结合在一起。要使酶作为电化学生物传感器的敏感膜使用,必须将酶固定在电极表面,即在电极表面覆盖一层敏感膜。在固定过程中,既要保持酶本身固有的特性,又要避免自由酶应用上的缺陷。因此酶的固定化技术决定着酶电极的稳定性、选择性和灵敏度等主要性能。丝网印刷是印刷业的一项传统工艺,有悠久的历史。20世纪60年代以后广泛用于电子工业生产,作为制作电路板的主要工序。1981年,一项专利文献报道将丝网印刷技术用于厚膜电化学传感器的制作。丝网印刷技术主要优点包括:①可以在表面印制各种图案,设计十分灵活;②印刷过程容易实现自动化;③重现性好;④适用于各种材质;⑤成本低廉,因此能够大批量生产重现性好的生物传感器。由于传感器成本很低,可以一次性使用,即所谓“用过即扔”,对临床检验非常方便。本研究将电化学酶传感器、纳米技术、丝网印刷技术、临床检验分析技术结合起来制备一次性酒精生物传感器,探讨了pH、缓冲液、温度、干扰物等对传感器响应电流的影响,并用于实际样品酒精浓度检测,表现出了良好的特异性、敏感性、重复性、稳定性,而且响应时间快、线性范围宽,为医学实验室和交通执法部门提供了一种快速检测血酒精浓度的参考。本研究主要分为以下两个部分:1.基于交联法固定酶的丝网印刷电极(screen-printed electrode,SPE)酒精生物传感器的制备。方法:1)丝网印刷电极的制备:在0.2mm厚的聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)薄膜上首先印刷一层导电银膜,再用碳浆印刷直径为3mm的圆盘作为工作电极,然后用PVC油墨印刷在导电银膜上作为绝缘层。2)Nafion-MB修饰电极的制备:丝网印刷电极在室温下依次用乙醇和超纯水超声清洗10min,然后在空气中晾干。将5%(w/w) Nafion-117溶液用无水乙醇稀释到1%(w/w),然后吸取5μL 1%的Nafion-乙醇溶液滴加在丝网印刷电极的工作区域,在空气中干燥,待电极表面干燥后形成一层Nafion膜。然后将Nafion修饰的丝网印刷电极置于含1mmol/L麦尔多拉蓝(Meldola’s blue, MB)的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS) (0.1mol/L,pH8.0)中用循环伏安法以50mV/s的扫描速度进行循环伏安扫描,使MB通过离子交换固定到Nafion膜中。3)酒精生物传感器的制备:把4mg乙醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase,ADH)、5mg NAD+(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)、10mg牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)溶于200μL磷酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH8.0)中,再加入20μL 2.5%戊二醛溶液充分混合;再吸取5μL此溶液滴加到已制备好的Nafion-MB修饰丝网印刷碳电极(screen-printed carbon electrode,SPCE)工作区域,在空气中干燥,溶剂蒸发后形成一层酶膜,制成酒精生物传感器。制成的酒精生物传感器在使用前被置于4℃冰箱保存。结果:所有测试均在电化学工作站中三电极系统下完成,饱和甘汞电极(saturated calomelelectrode,SCE)作为参比电极,铂丝作为对电极, Nafion-MB-酶修饰丝网印刷电极作为工作电极。该传感器在25℃时,以-0.17V(vs. SCE)作为工作电位,在pH为8.0的磷酸盐缓冲液中响应电流达到最大。传感器检出限为1.1×10-5mol/L,达到95%稳态响应时间不超过30S。用同一支生物传感器对含1mmol/L的酒精的磷酸盐缓冲液(pH8.0)重复测定10次,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为3.6%。在5个批次印制的丝网印刷电极中随机抽样5个电极制成酒精生物传感器,分别对含1mmol/L的酒精的磷酸盐缓冲液(pH8.0)重复测定3次取其平均值,相对标准偏差为4.3%。酒精生物传感器于4℃冰箱放置10、20、30天后,对相同浓度的底物响应电流分别减少了3.7%、5.2%、8.4%。甲醇、糖、乳酸、抗坏血酸等均不会影响生物传感器对酒精的响应。结论:该酒精生物传感器可以快速检测酒精浓度,表现出良好的特异性、重复性、准确性、稳定性和抗干扰能力,可以为实验室检测酒精浓度提供一个参考。2.基于Nafion和纳米金(gold nanoparticles,GNPs)固定酶的丝网印刷电极酒精生物传感器的制备。方法:1)纳米金的制备:取一定量的氯金酸溶液加热至沸,迅速加入柠檬酸钠溶液还原。所制备的溶液置于棕色瓶内于4℃保存。纳米金溶胶的颜色为亮红色,其粒径可用透射电子显微镜测试约为20nm。2)MB修饰的丝网印刷电极的制备:用聚酯作为生物传感器的基质材料,在聚酯上首先印刷一层导电银膜,再用混合2%(w/w)MB的碳浆印刷直径为3mm的圆盘作为工作电极,然后印刷UV胶作为绝缘层。银浆和碳浆印刷后,电极在40℃干燥2h以除去所应用油墨中的水分。UV胶印刷后需进行UV固化。3)酒精生物传感器的制备:MB修饰的丝网印刷电极在室温下依次用无水乙醇和超纯水超声清洗10min,然后在空气中晾干。把4mg ADH、5mg NAD+溶于200μL磷酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH8.0)中配成酶液。再把100μL酶液和100μL 5%(w/w)Nafion溶液充分混合。然后100μL纳米金溶液被加入以上溶液并充分混合。接着10μL混合溶液被滴加到MB修饰丝网印刷电极的工作区域,在空气中干燥,溶剂蒸发后形成一层酶膜,制成酒精生物传感器。制成的酒精生物传感器在使用前被置于4℃冰箱保存。结果:所有测试均在电化学工作站中三电极系统下完成,饱和甘汞电极作为参比电极,铂丝作为对电极,MB-酶-Nafion-GNPs修饰丝网印刷电极作为工作电极。该传感器在25℃时,以0.0V(vs. SCE)作为工作电位,在pH为8.0的磷酸盐缓冲液中响应电流达到最大。传感器检出限为1.6×10-5mol/L,检测上限达到了8mmol/L,达到95%稳态响应时间不超过40S。用同一个生物传感器在1天内对两个不同的酒精浓度(1和5mmol/L)分别连续检测10次,相对标准偏差为5.49和1.44%。从10批丝网印刷电极中随机抽取10支电极制成酒精生物传感器,然后用这10支不同的生物传感器分别对两个不同的酒精浓度(1和5mmol/L)进行检测,相对标准偏差为6.98和2.49%。酒精生物传感器于4℃冰箱放置10、20、30天后,对1mmol/L酒精响应电流分别减少了3.1%、4.6%、7.7%。甲醇、糖、乳酸、抗坏血酸等均不会影响生物传感器对酒精的响应。结论:该酒精生物传感器可以快速检测血酒精浓度,表现出良好的特异性、重复性、准确性、稳定性和抗干扰能力,可以为实验室检测血酒精浓度提供一个参考。