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研究目的:Corin是一种II型跨膜丝氨酸蛋白酶,主要表达于心脏的心肌细胞。其生物学功能是切割心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)前体,将其转化为ANP。有活性的ANP释放入血液,经血液循环到达靶器官,发挥调节血容量和血压的作用。Corin最初发现于心脏,随后的研究发现corin也表达于肾脏。小鼠、大鼠及人类肾脏中都发现有corin的表达。在大鼠肾病模型中,肾脏corin表达显著减少。我们前期研究也发现慢性肾脏疾病患者肾脏corin表达减少,尿液中可溶性corin水平降低。这些结果提示,corin在肾脏中的表达有一定的生理及病理意义。肾小管上皮细胞是位于肾小管腔表面的单层柱状上皮细胞,具有明显的细胞极性,其细胞极性与细胞膜蛋白极性分布是肾小管重吸收功能的结构基础。据报道,corin蛋白在大鼠肾小管的上皮细胞表达位置较为特殊,主要在肾小管上皮细胞顶端刷状缘的底侧。我们在人肾组织中也发现corin表达在肾小管的管腔侧,即肾小管上皮细胞的顶端侧。本课题中,我们将研究corin蛋白在人肾脏近曲小管上皮细胞上的分布以及亚细胞定位;研究corin在非极性心肌细胞与极性肾上皮细胞中的表达、活化及膜表面分布情况;并运用分子生物学及细胞生物学手段寻找调控corin在极性肾上皮细胞膜顶端选择性表达的关键结构元素,研究corin在极性细胞中特异性表达的机制。研究方法:(1)运用免疫荧光方法检测corin蛋白和金属蛋白酶neprilysin在人肾脏近曲小管中表达分布情况;用免疫电镜技术检测corin在人近曲小管上皮细胞的细胞亚定位。(2)运用免疫荧光技术检测corin在极性的犬肾小管上皮细胞(Madin-Darby Canine Kidney,MDCK),非极性的人胚肾上皮细胞 293(human embryonic kidney,HEK-293)及小鼠心房心肌细胞(HL-1)中的表达。(3)运用蛋白免疫印迹(Western blotting)的方法检测corin在MDCK细胞中的表达与活化;(4)以MDCK为极性细胞模型,用免疫荧光检测corin以及其他一些膜蛋白,如neprilysin、hepsin及matriptase等在MDCK细胞中的表达;(5)以人野生型corin质粒为模板,通过QuikChange Primer Design程序设计引物,利用突变体试剂盒(QuikChangeLightning Site-Directed Mutagenesis Kit)构建一系列corin的突变体。(6)运用免疫荧光技术检测野生型corin及其突变体在MDCK细胞中的表达。研究结果:(1)Corin蛋白在人肾近曲小管上皮细胞中的表达:免疫荧光检测发现corin蛋白表达在近曲小管刷状缘的底侧,而neprilysirn表达于近曲小管上皮细胞顶端的刷状缘;免疫电镜研究发现,corin特异表达于近曲小管上皮细胞的顶端膜上,侧边与基底边膜上未见corin蛋白的表达。(2)Corin在MDCK细胞中的表达:corin表达于MDCK细胞的顶端膜上,侧边与基底边膜上未见corin表达;neprilysin蛋白表达分布与corin的表达分布一致。Hepsin和matriptase则表达于MDCK细胞的顶端、侧边及基底侧,未见极性分布。在HEK-293和HL-1细胞上,corin蛋白未呈现特异的极性分布。(3)Corin在MDCK细胞中的表达和活化:我们发现与在HEK-293细胞中的结果类似,corin在MDCK细胞中可以表达并发生活化;发现corin在MDCK细胞膜上会发生脱落(shedding),产生三条分子量分别为～180、～160和～100kDa片的段;我们还发现MDCK细胞中corin蛋白分子量比在HEK-293细胞中大,并且这样的差异是由corin胞外域中不同程度的N-糖基化造成。(4)Corin突变体在MDCK细胞中的表达:我们发现corin胞内段缺失不影响corin在MDCK细胞中的顶端膜特异性表达;而corin胞外结构域地低密度脂蛋白受体结构域(low density lipoprotein receptor domain,LDLR)6-8 或清道夫受体结构域(scavenger receptor domain,SR)缺失后,corin蛋白不能特异性地表达在MDCK细胞的顶端膜上;此外,在cori血胞外结构仅保留LDLR6-8、SR和蛋白酶区,corin就能够特异性地表达在MDCK细胞的顶端膜上。(5)LDLR6-8结构域对corin顶端膜特异性表达的影响:我们发现LDLR6和LDLR7结构域的缺失不影响corin在MDCK细胞的顶端膜特异性表达;而LDLR78结构域缺失后,corin蛋白不能特异性地表达在MDCK细胞的顶端膜上。提示LDLR8结构域对corin的顶端膜特异性表达起重要作用。(6)SR结构域对corin顶端膜特异性表达的影响:我们发现SR结构域上N-糖基化位点的改变不影响corin在MDCK细胞中顶端膜的特异性表达;我们进一步发现SR结构域的氨基酸序列分段删除后,corin都不能特异性地表达在MDCK细胞的顶端膜。结论(1)Corin蛋白在人肾脏近曲小管上皮细胞顶端膜区特异性表达;(2)在极性细胞模型MDCK细胞中,corin能特异地表达于细胞膜顶端;而在非极性的HEK-293和HL-1细胞中,未见corin在细胞顶端膜的特异性表达;(3)与在HEK-293细胞中类似,corin在MDCK细胞中可以表达并发生活化,并且在细胞膜上发生shedding,产生三条大小不同的蛋白片段;(4)MDCK细胞中corin蛋白分子量比在HEK-293细胞中大,并且这一差异是由corin胞外域中不同程度的N-糖基化造成;(5)传统类型的细胞膜顶端分选信号,蛋白胞内段、N-连接的糖基化并不是corin在MDCK细胞中顶端膜特异性表达的分选信号;(6)Corin在MDCK细胞中的顶端膜表达的特异性依赖于SR结构域的完整性;(7)Corin蛋白的LDLR8和SR结构域是调控corin在MDCK细胞中顶端膜特异性表达的关键元素。综上所述,我们的工作揭示,corin在肾脏上皮细胞的表达与其在心脏及其它非极性细胞中的表达不同,在肾脏极性上皮细胞中,corin特异地表达于细胞顶端膜,这一膜极性表达受其LDLR8和SR结构域调控。Corin在肾脏上皮细胞中所特有的表达形式可能是corin在肾脏中发挥特异功能的分子基础。