肝脏是机体代谢的主要场所,其作用主要有维持氧化还原平衡、调节血糖以及蛋白质合成等。肝脏在物理或者化学刺激时,肝脏氧化还原失调,可导致自由基在组织中积累造成肝脏急性损伤。而肝纤维化是在各种肝损伤的情况下发生的持续性病理性损伤-修复过程,肝纤维化可进一步发展为肝硬化乃至肝癌,严重威胁人类健康。深入研究肝脏急性损伤到肝纤维化的发生发展,在细胞和分子水平探讨肝损伤到肝纤维化机理,从而针对相应的信号靶点来设计特定的治疗药物,达到延缓或阻断肝急慢性损伤的目的。在常见肝损伤中药物引起肝损伤最为严重。肝损伤常常伴随炎症的发生,其机制是产生亲电子产物、自由基等,造成脂质过氧化。而肝纤维化的特点是细胞外基质（ECM）的合成与降解失衡,大量积累。TGF-β₁被认为是HSC最有效的活化因子,通过TGF-β/Smad信号通路发挥促纤维化作用,目前研究显示在TGF-β/Smad信号通路中pSmad2C和pSmad2L传递促纤维化和促迁移信号,pSmad3C传递的细胞生长抑制信号,pSmad3L传递细胞侵袭和ECM积累信号。丹酚酸B（Sal B）为丹参的根及根茎提取而得,具有抗氧化作用和抗纤维化作用^[1],前期研究发现Sal B可通过调节氧化应激和TGF-β/Smad信号通路发挥作用。但是在此过程中Sal B如何调节pSmad2和pSmad3不同位点磷酸化尚不清楚,而且Sal B抗氧化作用是否影响Nrf2/HO-1通路也未见报道。本研究用CCl₄诱导小鼠急性肝损伤、肝纤维化,用H₂0₂诱导HSC-T6氧化损伤,并用Sal B干预。观察Sal B抗急性肝损伤和肝纤维化作用及其分子机制研究,尤其是在pSmad2和pSmad3不同位点磷酸化的调节和Nrf2/HO-1通路方面进行探讨。目的:1、目前研究显示Sal B具有抗急性损伤和抗肝纤维化作用,能改善肝功能,在此基础上本实验通过病理染色和胶原纤维染色进行分析、评价Sal B对CCl₄致小鼠急性肝损伤和肝纤维化组织病理学改变的影响。2、通过检测肝功能指标和组织氧化应激指标,分析Sal B在CCl₄致小鼠急性肝损伤和肝纤维化中的抗氧化作用。3、观察在CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤、肝纤维化模型及Sal B干预下,pSmad2C、pSmad2L、pSmad3C、pSmad3L以及Nrf-2/HO-1水平变化。分析Sal B抗CCl₄诱导的急性肝损伤、肝纤维化作用与不同位点pSmad2,pSmad3信号转导以及Nrf-2/HO-1信号通路之间的关系。4、观察Sal B对H₂O₂诱导的HSC-T6细胞损伤中Smad2磷酸化蛋白（pSmad2C、pSmad2L）以及Nrf-2/HO-1蛋白水平的影响,分析Sal B对pSmad2C、pSmad2L调控作用及Nrf-2/HO-1在此过程中的作用。方法:1、在体内实验中分析丹酚酸B抗CCl₄诱导的急性肝损伤和肝纤维化作用及与Nrf2/HO-1以及TGF-β/Smad通路的关联机制急性肝损伤:6-8周龄小鼠分为正常组、模型组和Sal B组（7.5、15、30 mg/kg）及阳性药物组（秋水仙碱0.1 mg/kg）,模型组、Sal B组及秋水仙碱组小鼠腹腔注射（ip）CCl₄（0.1%CCl₄ 10 mg/kg/次,每周2次）,正常组给与等量的溶媒（橄榄油）;Sal B组及秋水仙碱组每日灌胃给与相应剂量药物,正常组和模型组平行给予溶媒（生理盐水）1周后处死。慢性肝损伤（肝纤维化）:6-8周龄小鼠分为正常组、模型组和Sal B组（7.5、15、30 mg/kg）及阳性药物组（秋水仙碱0.1 mg/kg）,模型组、Sal B组及秋水仙碱组小鼠腹腔注射（ip）CCl₄（20%CCl₄ 1 mg/kg/次,每周2次）,正常组给与等量的溶媒（橄榄油）;Sal B组及秋水仙碱组每日灌胃给与相应剂量药物,正常组和模型组平行给予溶媒（生理盐水）8周后处死。检测小鼠血清中的ALT和AST水平。取出肝脏用多聚甲醛固定并用石蜡包埋,用苏木精和伊红（HE）染色察看肝脏的病理学转变,VG染色观察各组肝纤维化程度。小鼠肝组织中氧化应激指标用超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）及丙二醛（MDA）试剂盒检测。采用免疫组化染色检测pSmad2C、pSmad2L及Nrf-2分布情况,用免疫印迹试验检测pSmad2C、pSmad2L、pSmad3C、pSmad3L、Nrf-2、HO-1水平变化情况。2、体外细胞实验中观察丹酚酸B对H₂O₂诱导的HSC-T6细胞损伤中Smad2磷酸化蛋白（pSmad2C、pSmad2L）以及Nrf-2/HO-1水平的影响。体外常规培养HSC-T6细胞至对数生长期。实验分为对照组、H₂O₂组以及Sal B（25,50,100 mmol/L）三个剂量组,于培养结束前24h更换无血清培养基,Sal B组加入相应剂量药物;12h后,H₂O₂组、Sal B干预组加入100μM H₂O₂,对照组加入等体积溶媒。待6h后,各组加入细胞裂解液,并用细胞刮充分收集细胞,然后提取总蛋白,免疫印迹试验检测样本中pSmad2C、pSmad2L、Nrf-2、HO-1蛋白表达水平结果:1 Sal B缓解CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化病理进程,并干扰pSmad2L/C,pSmad3L/C信号转导,增强Nrf-2/HO-1信号1.1 Sal B缓解CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化病理改变急性肝损伤阶段:HE染色后可观察到正常组小鼠肝脏组织中细胞核被深染显蓝色,细胞质被染红色,细胞向汇管区有序排列,未见细胞坏死。在CCl₄刺激后肝组织可见炎细胞浸润和细胞病变。而丹酚酸B各剂量组炎细胞浸润减少,细胞病变情况改善。肝纤维化阶段:HE染色后可观察到正常组小鼠肝脏组织细胞向汇管区有序排列,未见细胞坏死,VG染色未见胶原纤维。在CCl₄刺激后,模型组肝组织可见纤维化病变和细胞坏死,结合VG染色可见汇管区出现严重纤维化。与模型组比较丹酚酸B各剂量组呈浓度依赖性地减少胶原纤维增生。1.2 Sal B改善CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化血清ALT、AST急性肝损伤阶段:结果显示CCl₄刺激后模型组ALT、AST水平显著升高;丹酚酸B中、高剂量组ALT、AST水平均显著降低。肝纤维化阶段:结果显示CCl₄刺激后模型组血清ALT、AST水平显著升高;丹酚酸B中、高剂量组ALT、AST水平显著降低。1.3 Sal B改善CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化组织氧化应激指标急性肝损伤阶段:CCl₄刺激后小鼠肝组织中SOD活力显著降低,而丹酚酸B高剂量组明显升高（改善）;CCl₄刺激后小鼠肝组织中GSH水平显著降低,丹酚酸B中、高剂量组明显升高;CCl₄刺激后MDA水平明显升高,而丹酚酸B中、高剂量组均明显减少。肝纤维化阶段:CCl₄刺激后小鼠肝组织中SOD活力显著降低,而丹酚酸B中、高剂量组明显升高（改善）;CCl₄刺激后小鼠肝组织中GSH水平显著降低,丹酚酸B中、高剂量组明显升高;CCl₄刺激后MDA水平明显升高,而丹酚酸B低、中、高剂量组均明显减少。1.4 Sal B调控CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化组织中pSmad2C、pSmad2L、pSmad3C、pSmad3L表达在CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤实验以及肝纤维化模型中,pSmad2C、pSmad2L、pSmad3L蛋白水平显著上调,而丹酚酸B呈浓度依赖性地抑制其上调。CCl₄刺激后pSmad3C无显著性改变,而丹酚酸B呈浓度依赖性地增强其表达。1.5 Sal B上调CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化组织中Nrf2、HO-1的表达在CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤实验中,Nrf2和HO-1蛋白水平上调但无显著性,而丹酚酸B呈浓度依赖性增强Nrf2和HO-1蛋白表达,免疫组化检测显示,在肝组织中Nrf2表达较少,而丹酚酸B呈浓度依赖性地增强Nrf2蛋白表达。而在CCl₄诱导的小鼠肝纤维化实验中,Nrf2和HO-1蛋白水平显著性上调,而丹酚酸B各组Nrf2蛋白表达较模型组下调,免疫组化检测显示,CCl₄诱导小鼠肝纤维化后肝组织中Nrf2表达显著增加,且Nrf2多见于汇管区纤维化周围,而在丹酚酸B各组中,因纤维化的减少肝汇管区周围Nrf2的表达区域缩小。2 Sal B对H₂O₂诱导的HSC-T6细胞损伤中Smad2磷酸化蛋白（pSmad2C、pSmad2L）以及Nrf-2/HO-1水平的影响2.1 Sal B下调H₂O₂诱导的HSC-T6细胞损伤中pSmad2C、pSmad2L在H₂O₂刺激下,HSC-T6细胞pSmad2C、pSmad2L蛋白表达增加,而Sal B各剂量组,可呈浓度依赖性的抑制H₂O₂刺激引起的pSmad2C、pSmad2L上调。2.2 Sal B上调H₂O₂诱导的HSC-T6细胞损伤中Nrf-2、HO-1在H₂O₂刺激下,HSC-T6细胞中,Nrf-2、HO-1蛋白表达变化不明显,而Sal B预处理组中丹酚酸B呈浓度依赖性的增强Nrf2和HO-1蛋白表达。结论:1.Sal B具有抗CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤和肝纤维化作用2.Sal B通过抑制pSmad2C、pSmad2L,pSmad3L和促进pSmad3C表达发挥作用。提示Sal B抗急性肝损伤和肝纤维化作用与Smad2和Smad3的C末端和连接区磷酸化有关;Sal B增强Nrf2和HO-1蛋白表达,提示Sal B增强Nrf-2/HO-1信号发挥抗氧化损伤作用。