随着分子生物技术，尤其基因技术和理论的飞速发展，基因治疗在肝癌治疗中的研究越来越深入方法。如何安全有效地介导目的基因转染入靶细胞是基因治疗的关键步骤。近年来研究表明超声造影剂作为一种辅剂能进一步提高超声介导转染的效能，特别是最近开发的新型超声造影剂，如Optison、SonoVue，对促进超声介导基因转染的作用具有较大的潜力。在超声局部辐照的作用下，造影剂微泡通过空化效应，提高细胞膜的通透性，使得载体携带目的基因，能有效地进入靶细胞内。 单纯疱疹病毒I型的胸腺激酶基因(herpes simplex virus thymidine Kinasetyper 1，HSV-1-tk)是目前使用最为广泛的自杀基因。本课题通过体外实验探讨超声造影剂增强超声辐照对增加HepG2细胞膜通透性的可能性；重组构建含甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)启动子的真核表达质粒pEGFP-C1-AFP-tk质粒；研究SonoVue介入下超声辐照增强真核表达质粒pEGFP—C1—AFP-tk质粒的效能，为建立超声造影剂增强超声辐照介导的肝癌基因治疗的新模式奠定初步的实验基础。 采用特制的专制的24孔培养板。人肝细胞癌细胞株HepG2由中山大学动物中心细胞库提供(AFP阳性，ATCC：HB-8065)。声学造影剂：SonoVue(Bracco公司，意大利)。异硫氰酸荧光素钠标记的右旋糖苷(Fluorescent isothiocyanate-dextran，FITC，FD-500S，Sigma公司，美国，以PBS配制，浓度10mg/ml。彩色多普勒超声成像仪(HP-Viewpoint 2500，美国)，经颅连续多普勒探头，频率1.9MHz。流式细胞仪(Elite，Beckman-coulter，美国)，发射波长488nm，接收波长520nm，功率15mW。 实验方法如下： ●取对数生长期培养中的HepG2细胞，PBS冲洗2次，0.05％胰酶(含0.5mM EDTA)消化，终止消化后1000r/min离心5min。弃上清，用含10％FBS培养液重新制作细胞悬液并培养3h后，重新制作细胞悬液，加入24孔培养板内，细胞数1.5×10<5>/孔。每孔加入荧光标记物FD-500S 50μl(10mg/ml)。配制好细胞悬液后即移往超声照射场行辐照实验。 ●SonoVue液配制：取1ml PBS缓慢注入SonoVue冻干粉瓶内，静置备用。使用前用力振摇以产生微泡。 ●辐照实验分四组： A组(n=5)：细胞悬液，不发射超声；B组(n=5)：细胞悬液内添加SonoVue 50μl，不进行超声辐照；C组(n=5)：超声辐照，辐照时间60秒，探头频率1.9MHz，TIS设置为0.8，增益为80％，输出声强ⅠSATA为80.0mW/cm<2>；D组(n=5)：添加SonoVue(剂量同B组)后，进行超声辐照(辐照条件同C组)。 细胞膜通透性检测：辐照实验完毕，即刻用PBS反复洗涤、悬浮、高速离心以除净细胞外FD500。用流式细胞仪检测荧光染色阳性的细胞(FD500进入细胞内)，每孔标本检测10000个细胞，计算阳性率。 二、结果 1.经0.025％胰酶消化的悬浮HepG2为圆形，台盼蓝(Trypan)试验细胞活性率大于95％。 2.流式细胞仪测定的荧光染色阳性细胞百分率分别为：无超声辐照(A组)或单纯添加SonoVue(B组)分别为3.064±1.57％和1.4±0.04％。经超声辐照(C组)后为23.72±14.4％(与A，B组比较P值均小于0.001)，添加SonoVue辐照(D组)后显著增加至54.78+43.6％(与A，B组比较P值均小于0.001，与C组比较P小于0.05)。 第二部分 重组真核表达质粒pEGFP-C1-AFP-tk的构建 一、 材料 主要试剂有Hindc，XhoⅠ，SalⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶，DNAMarker(DGL2000，λDNA／HindⅢ)，Taq酶和pMD-18及DNA纯化试剂盒。质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒、小量基因组DNA极速抽提试剂盒DNAfast2000，以及胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂，氨苄青霉素，卡那霉素，DMEM、胎牛血清，其它化学分析纯试剂。 二、 分子生物学实验方法流程 1)制备感受态细菌DH5α。→细菌的转化(质粒转化大肠杆菌)→制备质粒→质粒的酶切鉴定→制胶和上样→小量胶回收试剂盒→连接、转化反应 2)HepG2细胞基因组DNA的提取人肝癌细胞HepG2复苏后，置于DMEM培养液(含10％胎牛血清)中，在37℃、含5％CO<,2>的条件下培养。采用细胞DNA小量抽提试剂盒，按其说明进行人肝癌细胞株HepG2细胞DNA的提取。 3) AFP启动子PCR扩增 抽提人肝癌细胞HepG2的基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增人AFP基因启动子序列300bp。 4)PCR产物的回收与纯化利用凝胶回收试剂盒，回收PCR产物并纯化。 5)重组质粒pMD-18-AFP的构建回收PCR产物。与pMD-18载体进行联结反应。制备含氨苄青霉素琼脂平板。于平板表面加X-gal 40 μl和IPTG 4μl，构建成pMD-18-AFP,送上海生物技术工程公司进行测序。 6)构建成pEGFP—C1-AFP-tk pMD-18-AFP经XhoⅠ／HindⅢ酶切后，得到一约0.4kb大小的AFP基因启动子序列，经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化后克隆人pBluescriptⅡKDR-tk中相同酶切位点，然后用XhoⅠ／SalⅠ酶切，从中取下AFP-tk完整表达盒，并将其以相同克隆位点插人到pEGFP-C1中，构建成pEGFP-C1-AFP-tK，送交测序、电泳鉴定。 三、结果 测序结果及电泳结果显示所构建质粒符合pEGFP—C1-AFP-tk大小序列一致。 pEGFP分别经SalⅠ和．XholⅠ酶切电泳均显示为单一的300kb条带，分析pEGFP图谱(图4)，该质粒含SalⅠ和XholⅠ单克隆酶切位点，质粒全长大小约为8 kb，可验证所得质粒为pEGFP—C1-AFP-tk。质粒扩增：制备的pEGFP—C1-AFP-tk纯度测定OD260／280为1.87。 第三部分 SonoVue增强超声辐照pEGFP-C1-AFP-tk质粒转染HepG2细胞 一、pEGFP-C1-AFP-tk质粒的扩增、提取纯化及鉴定 一)、材料 人肝癌细胞HepG2，真核表达质粒pEGFP-C1-AFP-tk。主要试剂和材料：胎牛血清购于杭州四季清生物工程公司，0.25％胰蛋白酶溶液(Sigma公司)，PBS。质粒纯化提取试剂盒(EndoFree Plasmid Purification：Maxi Kit，Qiagen公司) 二)、方法 根据Qiagen Endoree Plasmid Purification Maxi Kit)试剂盒要求，按如下方法进行质粒提取：细菌培养，收集，溶解；细菌溶液的清洁；结合洗涤、再溶解DNA质粒。沉淀、洗涤再溶解DNA质粒。 三)、结果 用紫外分光度仪在260nm处，提取的重组质粒DNA浓度为35 μg／ml，OD260／280=1.77，纯度满足以下实验的要求。 二、 SonoVue增强超声辐照pEGFP-C1-AFP-tk质粒转染HepG2细胞 一)、主要材料和仪器 二)、实验方法取对数生长期贴壁的HepG2细胞；人脐静脉上皮细胞ECV-304终止消化后，用含10％FBS培养液重悬细胞并培养3小时后，以1.5x10<5>细胞／孔加入无菌6孔培养板内，每孔加入制备好的pEGFP-C1-AFP-tk质粒70μg／孔(70 μg／ml)，轻柔混匀，室温孵育20 min。 三)、 结果 1．荧光显微镜观察转染效果 2．流式细胞仪检测GFP瞬时转染表达效率 三、 SonoVue对超声辐照介导绿色荧光蛋白质粒转染HepG2细胞的对细胞增殖的影响及其对细胞的毒性影响 一)、材料和方法 二)、结果 细胞生存率：48 h后各组细胞生存率(n=5)：A组、B组、C组、D组、E组分别为93.6±1.4％、92.6±2.2％、94.0±0.9％，92.1±2.3％、89.1±6.1％，其中E组与A、B、C组P＜0.05，与D组比较P＞0.05。 第四部分 结论 1.因此，超声造影剂能明显增强超声辐照对HepG2细胞膜的通透性作用，有利于大分子物质进入细胞内，有希望用于是肿瘤分子生物学治疗的介导手段之一。 2.超声造影剂SonoVue能够显著增强超声辐照介导pEGFP-C1-AFP-tk转染HepG2的效率，且具有良好的靶向性。 3.超声造影剂SonoVue在显著增强超声辐照介导pEGFP—C1-AFP-tk转染HepG2效率的同时，对细胞活性影响很小，可作为目的基因转染方法。