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鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)是当前危害养鸭业最为严重的病原菌之一,其引起的病症称为鸭传染性浆膜炎。该病几乎存在于所有的水禽养殖区,发病率和死亡率高,病原菌血清型复杂且耐药性严重。对RA毒力因子和致病机制的研究不甚深入,已确定的毒力因子很少,且大部分仍处于推测阶段。补体系统(Complement system)是机体固有免疫的重要组成部分。病原菌一旦侵入机体,补体系统便会立刻被激活,通过一连串的级联反应,最终会形成攻膜复合物(Membrane Attack Complex,MAC)将病原菌直接裂解。病原菌侵入机体后,补体系统中的C3b会沉积在其表面,并通过与巨噬细胞表面的C3b受体结合,调理巨噬细胞吞噬病原菌。为了顺利地侵入机体进而在宿主体内繁殖扩散,病原微生物首先需要逃避宿主补体系统的“捕获”。在与机体免疫系统“斗智斗勇”的过程中,大多数细菌已进化出了多种逃避宿主补体免疫的机制,例如分泌蛋白酶与补体组份作用抑制补体活性。不过,目前有关RA逃避宿主补体免疫机制的研究,仍为一片空白。本研究在已纯化获得RA胞外蛋白酶EcpS(Extracellular protease S,EcpS)及其N端氨基酸残基序列的基础上,克隆及原核表达其编码基因以研究该酶对宿主补体系统杀菌活性、吞噬调理、溶血活性等生物学功能的影响,建立特异性补体路径ELISA(psc-ELISA)探索EcpS对各补体激活路径的作用,并测定RA菌体表面沉降的C3b和C4b含量以筛选EcpS作用于补体系统的靶蛋白范围。通过以上研究,以期为进一步探索EcpS的特性,阐明RA的致病机制提供理论证据。根据前期测得的RA-AF株s基因全序列,设计并合成4对引物,扩增片段不重复且长度分别为1062bp、1113bp、910bp和1021bp。以RA血清2型AF株基因组DNA为模板进行PCR扩增,琼脂糖电泳检测,切胶、回收目的DNA片段,与p MD19-T连接后转化感受态细胞E.coli DH5α,阳性克隆测序及序列的比对分析,4个扩增片段在核苷酸及氨基酸序列与RA-AF株s基因序列相似性均在99%以上。重组克隆质粒用Bam H I和Hind III酶切并回收目的片段,与线性化表达载体p ET32b连接后转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3),阳性克隆以自诱导方式进行表达。SDS-PAGE检测结果显示,4种重组蛋白均以胞内可溶性形式存在。重组蛋白与矿物油佐剂制备的免疫抗原免疫健康家兔制备抗血清。Werstern-blot检测,抗血清能与RA AF株培养物上清滤液发生特异性反应。明胶液化抑制试验表明,抗血清可以完全抑制RA-AF株上清滤液的液化明胶活性。EcpS预先与新鲜鸭血清孵育后与RA共孵育,利用平板计数法,计算活菌数,结果显示EcpS可极显著抑制补体的直接杀伤作用(p<0.001);吞噬调理活性试验中,将血清与酶预孵育后同时加入RA与巨噬细胞共孵育,利用平板计数法,计算活菌数,结果显示EcpS可极显著抑制宿主补体的吞噬调理作用(p<0.001);采用自改良的方法测定补体总补体溶血活性(CH50)以及旁路途径溶血活性(APH50),测得EcpS可显著抑制CH50的活性(p<0.05)而对APH50无明显影响。兔抗重组蛋白S1和S2血清能抑制EcpS对宿主补体系统的作用。以RA AF株为研究对象。将新鲜鸭血清与RA作用后,用洗脱液将RA表面沉积的蛋白洗脱。利用鸭C3d/C4d检测试剂盒,分别检测洗脱液中C3b和C4b含量。结果显示:EcpS可显著抑制宿主C3b(p<0.05)、C4b(p<0.001)在细菌表面的沉积作用。利用大肠杆菌脂多糖(LPS)、酵母甘露聚糖(Mannan)和人Ig M分别构建特异性的补体旁路途经、凝集素途径、经典途径ELISA。将血清与EcpS预孵育后,建立的psc-ELISA分别检测EcpS对宿主补体激活路径的影响。结果显示:EcpS可极显著抑制凝集素途径的激活(p<0.001),而对旁路途经和经典途径无明显影响(p>0.05)。本文在测定RA胞外蛋白酶EcpS抑制鸭的血清补体杀菌、吞噬调理及溶血活性等生物学功能的基础上,进一步研究了该酶阻抑C3b、C4b在细菌表面的沉积及抑制宿主补体系统经凝集素与经典激活途径激活。上述结果表明,胞外蛋白酶EcpS抑制宿主补体系统的活性是鸭疫里默氏菌逃避清除的途径之一。