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菊粉是一种天然果聚糖,菊粉内切酶能够水解菊粉生成低聚果糖,低聚果糖是一种功能性食品添加剂,其保健作用体现在能够降低血糖水平,促进人体和动物肠道的微生态平衡和提高免疫力等等。利用微生物菊粉内切酶可以一步法水解菊粉获得高达80%的低聚果糖,但是只有少数微生物产菊粉内切酶,并且产酶量极低,从而造成分离纯化困难,制约低聚果糖工业的发展。本研究的主要目的就是构建菊粉内切酶的工程酵母来高效表达菊粉内切酶,为解决目前低聚果糖生产中的问题提供有效的解决途径。 本研究以黑曲霉9891的基因组DNA为模板进行PCR扩增获得了编码菊粉内切酶的基因,并将它克隆进表达载体pPIC9,经过酶切、PCR和测序验证后,将重组表达载体pPIC9-Endoinu经BglⅡ酶切线性化后电转化到Pichia pastoris GS115中。重组子通过营养缺陷型培养基进行筛选。重组菊粉内切酶在Pichia pastoris GS115中实现了表达并在7L发酵罐中对其进行了优化表达研究,蛋白分泌量达2.15mg/ml。表达产物的SDS-PAGE分析表明,蛋白质分子量大小约为59KD。菊粉内切酶的活性测定结果为1501U/ml(以蔗糖为底物)和291U/ml(以菊粉为底物),同原始供体菌株相比,分别高105倍和273倍,通过酶学特性研究显示该酶反应最适pH为5.6,最适温度是55℃。同时还对菊粉内切酶的高级结构进行了模拟,得到了该蛋白的高级结构的初步信息。根据SDS-PAGE电泳和酶的功能性分析,证明目的蛋白已在Pichia pastoris中成功实现表达。且重组转化子-Pichia pastoris GS115/9891(I1-27)遗传稳定性良好。同时完成了中试生产线建设设计方案,包括菊粉内切酶水解生产菊粉寡糖的工艺设计;设备选型;低聚果糖工艺生产设备平面布置初步方案等酶法生产菊粉寡糖的生化工程的下游工作。