噬菌体感染是微生物发酵工业面临的一个棘手问题,至今仍无良策。本研究致力于探索基于CRISPR-Cas技术的噬菌体感染问题的解决方案。本文以肺炎克雷伯杆菌为例,从噬菌体的分离与分析开始,探究了天然CRISPR-Cas系统与(前)噬菌体之间的相互作用关系,建立了基于CRISPR-Cas9的噬菌体基因组编辑技术,探索了增强CRISPR-Cas9的噬菌体抗性水平的方法。本文的研究既包括利用公共数据库中的资源从生物信息学的角度进行的理论分析,也有从实验的角度对相关问题进行的探索论证。主要研究结果如下:首先,对感染肺炎克雷伯杆菌工业发酵菌株的噬菌体进行了分离、生理特性和基因组分析,并考察了噬菌体感染对1,3-丙二醇发酵过程的影响。系统进化树的分析结果显示,噬菌体phiKpS2属于Kp34属肺炎克雷伯杆菌噬菌体,是一类在自然界分布广泛的克雷伯杆菌噬菌体。发酵实验表明,噬菌体感染会导致发酵长时间停滞,发酵周期延长,生产效率降低。此外,发现噬菌体感染对细胞生长和代谢的影响与感染时细胞所处生长阶段有密切关系。其次,对肺炎克雷伯杆菌的CRISPR-Cas系统和前噬菌体进行了系统的生物信息学分析。鉴定出了一种新的Ⅰ型CRISPR亚型,命名为I-E*,并对其基本特征包括在染色体上的位置、基因的组织结构、Cas蛋白、tracrRNA的结构、PAM位点和进化来源等进行了确定;CRISPR间隔序列主要来源于噬菌体、前噬菌体和质粒,提示其主要功能是防止外来遗传元件入侵。揭示了前噬菌体是肺炎克雷伯杆菌基因组可塑性的重要原因之一;在全球范围内流行的CG258型菌株含有较多高度保守的前噬菌体,包括其特有的两个P2-P4噬菌体系统;肺炎克雷伯杆菌染色体上的获得型抗生素抗性基因(aARGs)集中存在于CG258型和CRISPR 阳性菌株中,其中CG258型菌株的aARGs有60%位于前噬菌体区域,而CRISPR 阳性菌株的aARGs仅有10%位于前噬菌体区域,显示CRISPR-Cas系统和CG258的前噬菌体可能分别独立地参与了ARG在染色体上的整合。发现CRISPR-Cas系统和前噬菌体的分布都依赖与菌株的MLST分型,且CRISPR中存在高比例的自我靶向的间隔序列:这些可能是在肺炎克雷伯杆菌中CRISPR-Cas系统对前噬菌体的存在影响有限的原因。接着,对5株潜在肺炎克雷伯杆菌工业菌株的前噬菌体诱导性进行了检测,对其中一株菌的前噬菌体诱导过程进行了定量分析,并对诱导出的两个前噬菌体进行了全基因组分析。实验结果显示,肺炎克雷伯杆菌在丝裂霉素C(MMC)诱导下易发生前噬菌体大量增殖,细胞裂解死亡。其中,肺炎克雷伯杆菌W3的基因组中有2个可诱导的前噬菌体,且存在自发诱导现象。诱导出的噬菌体PKPW3.1和PKPW3.3在NCBI phage数据库中没有同源噬菌体,说明是新的噬菌体类型。对前噬菌体携带的tRNA分析显示,PKPW3.1和PKPW3.3中含有三种tRNA(tRNA-Arg,tRNA-Asn,tRNA-Thr),是肺炎克雷伯杆菌前噬菌体中最常见的tRNA类型。前噬菌体在基因组中的高丰度、可诱导性及自发诱导性,说明在以肺炎克雷伯杆菌为基础的发酵工业中前噬菌体是导致噬菌体感染的风险因素之一。然后,建立了一种基于CRISPR-Cas9的肺炎克雷伯杆菌噬菌体基因组编辑技术。揭示了30-60 bp的短同源臂可以高效地实现包括点突变、基因删除和插入、移码突变在内的多种遗传操作,从而大大简化了基于CRISPR-Cas的噬菌体基因组编辑中繁琐的模板构建过程。通过对177个sgRNA的预测活性与实际测定活性的相关性分析,证实来源于真核生物的sgRNA预测模型不能用来预测针对噬菌体的sgRNA活性。揭示了低活性的sgRNA也可以用来进行基于同源重组的噬菌体基因组编辑,通过移码突变可以快速的判断噬菌体基因的必需性;并以噬菌体phiKpS2为例,通过移码突变和基因删除等,对其17%的基因的必需性进行了初步验证。最后,分析了针对噬菌体的sgRNA的活性分布,考察了噬菌体从单一靶标和多靶标CRISPR-Cas系统中逃逸的机制,发现通过表达Mu Gam干扰噬菌体DNA双链断裂修复可显著增强CRISPR-Cas系统噬菌体抗性。在针对噬菌体的sgRNA中,活性低的sgRNA数量较多。在177个sgRNA中,活性最低的那部分,即EOP>0.1的sgRNA约占49.7%,而EOP<10-4,即活性最高的那部分sgRNA仅占4.5%。噬菌体有多种逃逸CRISPR-Cas系统的方式,包括非同源末端接合、同源重组和靶向区域的大片度删除。5个sgRNAs串联的多靶标CRISPR-Cas系统可促进靶向区域的大片段删除,但没有显著增强菌株的噬菌体抗性。发现Mu Gam蛋白可显著增强CRISPR-Cas系统噬菌体抗性,且这种增强效应对不同活性的sgRNA均适用。表达Mu Gam后噬菌体逃逸的方式发生了改变,逃逸噬菌体中野生型和发生靶向区域大片段删除的突变体都增加了。未来在对肺炎克雷伯杆菌发酵菌株选育的过程中需要进行前噬菌体的诱导性检测,或考虑开发基于CRISPR-Cas系统的前噬菌体清除技术;另外,通过对噬菌体双链断裂修复机制的深入研究,未来可以设计更好的干扰策略来防止噬菌体逃逸。