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第一章游离脂肪酸培养的人脐静脉内皮细胞神经酰胺浓度变化及机制研究目的观察高浓度的游离脂肪酸:软脂酸(palmitate)、棕榈油酸(palmitoleate)、油酸(oleate)、亚油酸(linoleate)培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cells,HUVECs)内神经酰胺(ceramide)浓度变化,探讨在游离脂肪酸培养的血管内皮细胞是否存在神经酰胺积聚及可能的机制。方法①4种游离脂肪酸对细胞膜及细胞内神经酰胺的影响:HUVECs分别用600μM软脂酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸培养16小时,以高压液相色谱联合质谱的方法(liquid chromatography/ion spray ionization tandem masssepectrometryLC/MS/MS)检测细胞膜及细胞内神经酰胺浓度的变化。②软脂酸对细胞膜及细胞内神经酰胺的影响:HUVECs分别用200μM、400μM、600μM软脂酸培养16小时,600μM软脂酸培养4、8、16、24、32小时,以高压液相色谱联合质谱的方法检测细胞膜及细胞内神经酰胺浓度的变化。③神经酰胺基础合成途径特异性阻断剂myriocin和FB1对软脂酸培养人脐静脉内皮细胞神经酰胺的影响:HUVECs用600μM软脂酸+10μM myriocin培养16小时;或600μM软脂酸+10μM FB1培养细胞16小时以高压液相色谱联合质谱的方法检测细胞膜及细胞内神经酰胺浓度的变化。结果①软脂酸呈时间和剂量依赖性的升高人脐静脉内皮细胞细胞膜及细胞内神经酰胺的浓度,以16h变化最明显。高浓度棕榈油酸、油酸、亚油酸对人脐静脉内皮细胞细胞膜及细胞内神经酰胺的浓度无显著影响。②高浓度软脂酸显著升高人脐静脉内皮细胞细胞膜及细胞内神经酰胺的浓度,神经酰胺基础合成途径抑制剂Myriocin可以完全阻断软脂酸所致的细胞神经酰胺浓度增加。FB1也可以完全阻断软脂酸所致的细胞神经酰胺浓度增加。结论软脂酸显著升高人脐静脉内皮细胞神经酰胺的浓度,神经酰胺浓度升高与激活神经酰胺从头合成途有关,棕榈油酸、油酸、亚油酸对血管内皮细胞神经酰胺浓度均无影响。第二章神经酰胺在软脂酸培养的人脐静脉内皮细胞PKB/eNOS通路变化中的作用机制研究目的观察高浓度的软脂酸培养的人脐静脉内皮细胞IRS-1/PI3K/PKB/eNOS信号通路和NO浓度的变化,探讨神经酰胺积聚在IRS-1/PI3K/PKB/eNOS信号通路和NO浓度变化中的机制。方法①HUVECs分别在50nM胰岛素或50nM胰岛素+600μM软脂酸培养内皮细4、8、16、24、32小时,不同浓度软脂酸(200μM、400μM、600μM)培养内皮细胞16小时,Griess重氮化学反应法测定细胞上清液中NO浓度。②HUVECs分别在50nM胰岛素或50nM胰岛素+不同浓度软脂酸(200μM、400μM、600μM)培养16小时,western blot观察细胞IRS-1、PI3K、PKB、eNOS蛋白表达变化。③HUVECs+50μM Myriocin+50nM胰岛素+600μM软脂酸或HUVECs+10μMFB1+50nM胰岛素+600μM软脂酸,阻断神经酰胺积聚观察人脐静脉内皮细胞NO浓度和PKB/eNOS总蛋白及磷酸化蛋白的变化。④HUVECs+150μM NOE+50nM胰岛素+600μM的软脂酸或HUVECs+50μMPDMP+50nM胰岛素+600μM的软脂酸组;阻断神经酰胺降解观察人脐静脉内皮细胞PKB/eNOS总蛋白及磷酸化蛋白的变化。结果①软脂酸呈浓度依赖性抑制血管内皮细胞NO产生。②软脂酸抑制血管内皮细胞PKB、eNOS磷酸化,使NO产生减少,而总PKB、总eNOS及IRS-1/PI3K无显著变化。③Myriocin或FB1可完全阻断软脂酸诱导的内皮细胞神经酰胺积聚,改善PKB、eNOS磷酸化,促使NO产生增加。④PDMP和NOE显著升高软脂酸培养的内皮细胞神经酰胺的浓度,PKB/eNOS磷酸化受抑显著加重。结论高浓度软脂酸培养的血管内皮细胞内神经酰胺积聚是细胞PKB/eNOS通路活性下降、NO产生减少的机制,神经酰胺积聚部分介导了软脂酸所致的内皮细胞功能紊乱。在血管内皮细胞存在“高浓度软脂酸刺激-神经酰胺积聚-PKB/eNOS通路受损-NO产生减少-内皮细胞功能紊乱”这一反应。第三章罗格列酮对高浓度软脂酸培养的人脐静脉内皮细胞PKB/eNOS影响及作用机制研究目的:观察罗格列酮对高浓度软脂酸培养的人脐静脉内皮细胞(humanumbilical vein endothelial cells,HUVECs)神经酰胺(ceramide)浓度的影响及对一氧化氮(NO)浓度,蛋白激酶B(PKB)、内皮型一氧化氮合酶蛋白(eNOS)表达的影响,探讨罗格列酮改善内皮细胞功能的信号转导机制。方法:①不同浓度罗格列酮(5μM、10μM、30μM)培养HUVECs16小时,10μM罗格列酮HUVECs培养内皮细胞4、8、16、24、32小时,Griess重氮化学反应法测定细胞上清液中NO浓度。②不同浓度罗格列酮(5、10、30μM)培养HUVEs16小时,Western Blot测定PKB、eNOS蛋白及磷酸化PKB、eNOS蛋白表达的影响:③10μM罗格列酮干预600μM软脂酸培养的HUVECs,Griess重氮化学反应法测定细胞上清液中NO浓度和Western Blot测定PKB、eNOS蛋白及磷酸化PKB、eNOS蛋白表达的变化。④不同浓度罗格列酮(5μM、10μM、30μM)对600μM软脂酸培养的HUVECs神经酰胺浓度的影响,高压液相色谱联合质谱的方法测定细胞神经酰胺的浓度。结果①罗格列酮呈剂量时间依赖性增强血管内皮细胞NO产生。②罗格列酮增强血管内皮细胞PKB/eNOS磷酸化表达,对PKB和eNOS无显著影响。②格列酮显著改善软脂酸培养的血管内皮细胞PKB/eNOS的通路的活性,同时降低血管内皮细胞内神经酰胺的浓度。结论:罗格列酮对血管内皮细胞的保护作用与减少神经酰胺积聚,改善PKB/eNOS,上调NO产生有关,减少血管内皮细内神经酰胺生成是罗格列酮改善血管内皮细胞可能机制之一。