IL-4是Th2类细胞因子的代表，人类IL-4是成熟的糖蛋白，主要由活化的CD4T细胞分泌，γδT细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞也可分泌。IL-4作用于B细胞、T细胞以及肥大细胞等其他造血细胞系细胞，引导这些细胞的增殖，分化，并决定它们的活性。和GM-CSF共同作用，IL-4可促进外周血单核细胞转化为树突状细胞。IL-4在结核分枝杆菌感染免疫中起调节作用。 不同于αβT细胞，γδT细胞可直接识别并结合抗原分子，无需与MHC分予结合，无需APC提呈。它可直接识别多种多样的天然存在于分支杆菌的以及人工合成的非蛋白含磷分子抗原，甘油蛋白以及烷基胺类抗原。γδT细胞执行固有免疫防御，参与调节获得性免疫反应；促进皮肤伤口的愈合；维护皮肤粘膜屏障作用；抑制肿瘤细胞活性。虽然正常情况下γδT细胞仅占外周血T细胞的极小比例，但在一些感染性和非感染性疾病时，例如，结核分枝杆菌感染时，其比例大幅度提高，甚至可成为T细胞的主要类型。 本实验室发现，少数BCG感染的恒河猴的IL-4发生了变异，我们暂时将其命名为变异IL-4(variantIL-4，vIL-4)。本文针对其与野生型IL-4间的基因祖系关系以及它们之间可能存在的功能差异，进行了研究。 研究目的:构建恒河猴IL-4及vIL-4基因的重组质粒，运用生物信息学方法对其核苷酸及推测的氨基酸序列进行分析，明确vIL-4遗传背景及其与IL-4基因之间的关系。进行原核重组表达，得到高度纯化的IL-4和vIL-4重组蛋白，并对重组蛋白进行定量和Westen-blot鉴定。比较IL-4及vIL-4重组蛋白对外周血Vγ2Vδ2T细胞增殖效应间的差异及vIL-4可能的作用通路。进一步研究IL-4及vIL-4重组蛋白对BCG感染的恒河猴外周血Vγ2Vδ2T细胞活化及效应的影响。同时也比较了它们促外周血单核细胞转化为树突状细胞的作用。 研究方法: (1)IL-4及vIL-4基因的克隆：将本室保存的IL-4及vIL-4cDNAPCR产物克隆入原核表达质粒pET-30a(+)。重组质粒进行双酶切和测序鉴定。 (2)vIL-4序列分析：利用生物信息学工具进行vIL-4DNA及推测蛋白质序列的分析、比对，明确其遗传背景及与IL-4基因间的关系。并对推测的蛋白分子的重要功能位点进行预测。 (3)IL-4及vIL-4基因的重组表达及纯化：诱导表达重组质粒pET-30a(+)-IL-4和pET-30a(+)-vIL-4，对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。利用Ni-NTAagarose非变性纯化技术和BiologicDuoflowChromatography，Ionexchangechromatography(IEX)纯化系统，将IL-4及vIL-4重组蛋白高度纯化。用BCA蛋白分析定量试剂盒对纯化后的IL-4及vIL-4蛋白进行定量。 (4)IL-4及vIL-4重组蛋白的鉴定：利用鼠抗人IL-4单克隆抗体进行Western-blot实验，对IL-4和vIL-4蛋白进行初步鉴定。 (5)IL-4及vIL-4重组蛋白对外周血Vγ2Vδ2T细胞扩增影响：利用Ficoll-Paque梯度离心的方法分离外周血单个核细胞，将细胞分为阴性对照组、不同浓度IL-4及不同浓度vIL-4实验组进行体外培养。用50ngHMBPP预刺激3天，随后培养3天或7天，收集培养的细胞，利用直接或间接的方法进行细胞表面特异性抗体CD3、Vγ2和Vδ2的染色。进行流式细胞分析。 (6)IL-4及vIL-4重组蛋白对外周血Vγ2Vδ2T细胞增殖的作用：分离外周血单个核细胞，进行CFSE染色。随后细胞分为阴性对照组、10ngIL-4实验组及15ngvIL-4实验组，按最佳培养条件进行体外培养。收集培养的细胞，表面染色CD3和Vδ2，进行流式细胞分析。 (7)鼠抗人IL-4单克隆抗体(Anti-IL-4mAb)及鼠抗人IL-4受体α链单克隆抗体(Anti-IL-4RαmAb)阻滞实验：同样分离外周血单个核细胞，进行细胞培养。实验分组为：阴性对照组；10ngIL-4加不同浓度的Anti-IL-4mAb或不同浓度的Anti-IL-4RαmAb；15ngvIL-4加不同浓度的Anti-IL-4mAb或不同浓度的Anti-IL-4RαmAb。培养后收集细胞，表面染色CD3、Vγ2和Vδ2，进行流式细胞分析。(8)细胞内染色检测IFN-γ分泌：分离健康及BCG感染的恒河猴的外周血单个核细胞，细胞分为阴性对照组、10ngIL-4实验组及15ngvIL-4实验组，按最佳培养条件进行体外培养。收集细胞，进行细胞内染色IFN-γ，和细胞表面染色Vδ2、CD4和CD8，流式细胞分析。 (9)双夹心EILSA检测培养上清中的细胞因子：利用双夹心ELISA检测试剂盒检测上述培养上清中IFN-γ和TNF-α的含量。(10)单核细胞转化实验：分离外周血单个核细胞，利用灵长类MACSCD3MicroBead试剂盒阴性筛选非CD3+细胞，而后调整细胞数量，加入6孔平底细胞培养板，放置于37℃，5％CO2的培养箱中2小时，进行贴壁筛选。将所分离的单核细胞分为5组：阴性对照组；IL-4+GM-CSF组；vIL-4+GM-CSF组；IL-4组和vIL-4组。细胞培养3天后进行表面染色：PB-CD14；PE-CD1a；APC-CD11c；FITC-CD83，流式细胞分析。 研究结果: (1)本室所保存的IL-4及vIL-4cDNAPCR产物，经BamHI和SalI酶切后，定向克隆入原核质粒pET-30a(+)。DNA序列测定结果表明克隆质粒中所插入的IL-4DNA片段与已报导的序列一致。 (2)IL-4及vIL-4基因的起始密码子均为ATG，终止密码子为TGA及TAA。IL-4的cDNA序列长为393bp；vIL-4为582bp。IL-4与vIL-4序列的前291碱基完全相同。而后，vIL-4序列多出了151个碱基而此处正是IL-4第三个外显子结束的位置，即，vIL-4所插入的部分是在第三个外显子和第四个外显子之间；并且vIL-4所多出了151个碱基与人类IL-4基因第三个主要内含子的部分序列具有94％的同源性。随后的101个碱基，IL-4与vIL-4再次完全相同，为第四个外显子序列。 (3)vIL-4的氨基酸序列中存在8个半胱氨酸，预测它们可能形成4对二硫键；其中仅第一对二硫键Cys3-Cys127与IL-4的相同，提示两者关键结构可能存在差异。 (4)通过IPTG诱导，IL-4和vIL-4基因均在大肠埃希菌BL21中表达，SDS-PAGE电泳结果显示pET-30a(+)-IL-4融合蛋白条带在标准分子量接近20kD处，与理论预测值17kD相符；pET-30a(+)-vIL-4融合蛋白条带在标准分子量接近25kD处，与理论预测值24kD相符。利用Ni-NTAagarose非变性纯化技术和BiologicDuoflowChromatography纯化系统，将IL-4及vIL-4重组蛋白进行纯化。SDS-PAGE电泳结果显示重组IL-4及vIL-4蛋白被高度纯化。BCA蛋白分析定量试剂盒对纯化后的IL-4及vIL-4重组蛋白进行定量，结果显示IL-4与vIL-4蛋白浓度分别为160μg/ml和180μg/ml。 (5)当利用鼠抗人IL-4单克隆抗体进行Westen-blot实验时，IL-4重组蛋白结果为阳性，vIL-4重组蛋白结果阴性。以不同浓度的IL-4及vIL-4重组蛋白重复实验，结果相同。说明鼠抗人IL-4单克隆抗体可以识别IL-4重组蛋白但不能识别vIL-4重组蛋白。 (6)体外培养实验证明，用HMBPP预刺激后，vIL-4实验组外周血Vγ2Vδ2T细胞在CD3+细胞中的百分比增高，当vIL-4浓度达15ng时，其百分比最高。并且在培养7天后Vγ2Vδ2T细胞的百分比高于培养3天的结果，即，这一作用是浓度依赖型和时间依赖型。IL-4结果相似，但作用明显较弱，两者之间的差异具有普遍性和统计学意义。 (7)CFSE实验结果显示在IL-4作用下，有近50％的γδT细胞峰值左移表明它们被激活并进行复制，增殖；而在vIL-4作用下，近90％的γδT细胞都进行了增殖。再次证实了vIL-4促γδT细胞增殖的作用。 (8)随着鼠抗人IL-4单克隆抗体浓度的增加，IL-4所刺激Vγ2Vδ2T细胞扩增的百分比相应降低，直至消失与阴性对照一样，形成一条下降曲线；但它对vIL-4促进Vγ2Vδ2T细胞扩增作用无影响，仍为一条水平线。而随着鼠抗人IL-4Rα单克隆抗体浓度的增加，IL-4和vIL-4所刺激Vγ2Vδ2T细胞扩增的百分比均相应降低，直至消失，两者均形成下降曲线。 研究结论: 本实验证实从BCG感染的恒河猴中所发现的vIL-4是IL-4的mRNA前体分子在3-4外显子处发生不同的剪接所形成一个新的变体蛋白；与IL-4不同，它可以促进外周血Vγ2Vδ2T细胞的增值并且促进抗原特异性γδT细胞产生效应分子，提示其可能是一个不同于IL-4的新的细胞因子。vIL-4的这一作用是通过与IL-4受体α链结合而实现但其信号传导通路不同。而在促进外周血单核细胞向树突状细胞转化方面，vIL-4具有与IL-4一样的功能。因此，vIL-4更有利于宿主加强针对BCG感染的免疫。