纤维素酶作为饲料添加剂,可提高饲料利用率和粗饲料的营养价值,降低饲料成本,在促进动物生长、减少粪便排放、改善生态环境和动物疾病防治等方面效果明显,同时通过纤维素高效降解菌发酵处理秸秆,可以合成含有丰富蛋白质的菌体细胞,这些分解产物和菌体亦可用于单细胞蛋白饲料。乳酸菌是人和动物肠道内的常见细菌,被公认为安全级(Generally Recognized As Safe, GRAS)微生物。它作为一种益生菌,具有维持肠道菌群微生态平衡、可激活机体粘膜免疫反应、抑制肠道内病原微生物的生长、增强动物机体免疫力等多种生物学功能。另一方面,基因工程乳酸菌可以集益生和外源基因表达的双重功能于一身,在功能食品、医疗保健、人工口服疫苗等领域的应用均具有诱人的前景。本实验从奶牛、山羊瘤胃内容物以及腐烂饲草中通过羧甲基纤维素钠(CMC-Na)平板选择培养刚果红染色法初步筛选到能够产生明显透明圈的细菌菌株18株、真菌菌株33株,通过测定纤维素酶活性进行复筛,分离到高效纤维素降解真菌和细菌各一株作为后续实验研究对象,通过克隆真菌NL-3的18S rDNA序列,并以其同源性为基础构建相关种属的系统发育树。结果表明, 18S rDNA序列全长504bp, Blast显示该菌株与青霉菌属同源; NL-3菌株在进化关系上也与青霉菌属(Penicillium)聚成一族。特别是与Penicillium decumbens strain JU-A10的同源性最高,其序列相似性达99%。结合菌株形态学与18S rDNA基因序列分析对分离菌株进行鉴定,初步鉴定为青霉属的斜卧青霉(Penicillium decumbens)。同时克隆了细菌N9的16S rDNA序列。测序分析表明,其16S rDAN序列全长1514bp。BLAST显示该菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)同源。以同源性为基础构建了相关种属的系统发育树,该菌株在进化关系上与枯草芽孢杆菌聚成一族;结合生理生化特征及16S rDNA分子鉴定,将其鉴定为枯草芽孢杆菌。根据GenBank上已发表的枯草芽孢杆菌内切纤维素酶(eg)基因序列,针对pMG36e质粒的多克隆位点设计引物,以枯草芽孢杆菌N9的基因组DNA为模板,扩增eg基因序列。该基因序列全长1518bp,通过序列比对分析,eg与已报道的其它来源的内切纤维素酶的序列相似性最高在92%。并将其亚克隆至乳酸乳球菌表达质粒pMG36e中,构建重组乳酸乳球菌表达质粒pMG36e-eg。通过电转化方法将重组质粒转化至乳酸乳球菌MG1614感受态细胞,成功构建了产内切纤维素酶的基因工程乳酸菌。将此重组转化子点接至含CMC的M17平板上能够产生透明圈,收集表达产物后通过进行SDS-PAGE电泳、Western blot检测到内切纤维素酶分子量约54KD,与预期结果相吻合。本研究筛选到多株高效纤维素降解菌,并克隆了内切纤维素酶基因(eg),构建乳酸菌表达载体pMG36e-eg,构建了重组内切纤维素酶基因工程乳酸菌。以期利用乳酸菌表达系统得到高活性纤维素酶以及开发出产内切纤维素酶的多功能微生态制剂。