背景和目的:近日节律是一种内源性的生物计时系统,它使得生物能够适应以24小时为周期的昼夜环境变化,从而维持正常的生命活动。哺乳动物近日节律调节过程中两个最重要的正性调节分子是CLOCK和BMAL1,它们是驱动分子钟运行,促进下游基因节律性转录的关键。分子钟由几个相互连结的转录-翻译反馈调控环路组成,已有少量报道称某些microRNA(miRNA)也参与其中。miRNA是一类仅有22个核苷酸组成的小RNA分子,属于非编码RNA,它能够结合到靶mRNA上,调节多种生命活动。近年来越来越多的miRNA被发现和命名,相比于蛋白编码序列,对于miRNA功能(特别是那些参与调控生物钟的miRNA)的研究尚显不足。本研究提出的科学问题是miRNA如何调控生物节律,研究目的是寻找与核心钟基因clock调节相关的miRNA,并进一步研究其调节机制和对动物行为节律的影响。方法:首先利用生物信息学方法预测靶定clock mRNA 3’非翻译区(3’untranslational region,3’UTR)的miRNA;荧光素酶双报告基因实验确定实际靶定clock 3’UTR 的 miRNA,并最终确定 microRNA-1 7-5p(mir-17-5p)为研究对象;在细胞系中的过表达和干扰实验确证mir-17-5p对CLOCK蛋白表达的作用;通过细胞同步化来了解mir-17-5p的表达节律;采取荧光定量PCR和原位杂交的方法在小鼠视交叉上核(SCN)检测mir-17-5p的表达节律,使用Western blotting和免疫组化的方法了解相应时间点CLOCK的蛋白表达;构建过表达质粒和包装干扰病毒,研究节律性表达的mir-17-5p是否受生物钟的调控;染色质免疫共沉淀技术确定CLOCK是否直接结合于mir-17-5p的启动子区调节其转录;给C57BL/6J小鼠侧脑室注射mir-17-5p的拮抗剂antagomir和激动剂agomir检测小鼠转轮运动节律的改变;在体神经放电胞外记录技术监测antagomir-17-5p对小鼠SCN放电频率的影响;免疫组织化学的方法检测antagomir和agomir对相位相关的钟蛋白PER1和PK2表达的影响;在细胞水平探讨光照对mir-17-5p的可能调节作用。结果:mir-1 7-5p 能够结合到 clock mRNA 的 3’UTR;mir-1 7-5p 在 mRNA的3’UTR上有两个重要的结合位点;mir-17-5p的过表达下调CLOCK蛋白表达;抑制mir-17-5p的表达使CLOCK蛋白表达量增加;mir-17-5p的过量表达不能减少clock mRNA的量,却可以下调其蛋白表达量;mir-17-5p是通过抑制CLOCK蛋白翻译影响其蛋白表达;mir-17-5p在同步化的细胞中呈现节律性表达,峰值相位不同于CLOCK蛋白;不论是在光照:黑暗(light:dark,LD)还是在全黑暗(constant dark,DD)的条件下,mir-1 7-5p在C57BL/6J小鼠的SCN中都呈节律性表达,在昼夜交替时表达量较低,而在主观夜晚(subjective night)的晚期和主观白天(subjective day)的早期表达量较高,在大脑皮层则没有节律性表达;mir-17-5p在SCN的表达节律相位与CLOCK蛋白在胞浆表达节律的相位相反;在细胞系中直接过表达CLOCK和BMAL1不能引起mir-17-5p表达量的增高;稳定转染CLOCK干扰序列的细胞系中,mir-17-5p表达量降低;CLOCK能够作为转录因子直接结合到mir-17的转录调控区;小鼠侧脑室注射antagomir-17-5p使小鼠转轮运动的自由周期缩短15.72 ± 1.72 min,与对照组相比有显著性差异;将antagomir-17-5p注射到小鼠侧脑室后短时间内使SCN放电频率增加;小鼠侧脑室注射agomir-17-5p使小鼠转轮运动自由周期缩短16.27±3.012 min,与对照组相比有显著性差异;mir-17-5p的agomir与antagomir的注射都使相位相关钟蛋白PER1和PK2的表达量改变;在N2a细胞系中激活腺苷酸环化酶使得mir-17-5p表达量下调;mir-384-5p能够上调CLOCK蛋白表达;小鼠侧脑室注射mir-142-3p的antagomir使转轮运动节律的相位发生后移。结论:我们通过分子实验、细胞实验和动物实验,发现在小鼠SCN节律性表达的mir-17-5p能够调节小鼠转轮运动节律的自由周期,分子钟核心反馈环路的clock为mir-17-5p的重要靶基因。Mir-17-5p通过影响clock翻译的方式参与节律调控,其自身转录又受到CLOCK调节。我们的实验发现了新的近日节律调节相关的miRNA,这为组成分子钟的反馈环路增添了新的稳定因素,mir-17-5p也可能作为近日节律输出的重要中间分子。