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随着我国城市园林绿化事业的大力发展,每年产生了大量的园林绿化废弃物,如何将城市园林绿化废弃物变废为宝成为亟待解决的问题。以堆肥技术为代表的生物处理方法,可以实现园林绿化废弃物资源化利用,但园林绿化废弃物中木质素和纤维素含量高,导致堆肥效率低。为了加快园林绿化废弃物堆肥效率,拟从堆肥中筛选出高效的木质素和纤维素降解菌,并通过诱变技术提高它们对木质素和纤维素降解能力,并探讨其基因功能、扩繁工艺以及酶学特性。利用苯胺蓝和羧甲基纤维素(CMC)-刚果红培养基褪色圈法、实验室固态发酵试验、酶活力定量检测,共筛选到了3株相对优势的木质素和纤维素降解菌:枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BL03、曲霉菌属(Aspergillus sp.)BL06、土芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)BL15,其中 B.subtilis BL03 产 CMC 纤维素酶和漆酶,Aspergillus sp.BL06 产木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶,Geobacillus sp.BL15产CMC纤维素酶。利用常压室温等离子(ARTP)对分离出的菌诱变并定向筛选,发现Aspergillus sp.BL06对ARTP诱变不敏感、致死率不明显,而Geobacillus sp.BL15诱变后未筛选到有明显突变的菌株,故暂停该两株菌的诱变和筛选工作。控制B.subtilis BL03诱变条件,使其在致死率约95%进行诱变。基于酶标仪,以对苯胺蓝脱色率为指标,结合在CMC-刚果红培养基褪色圈直径,对B.subtilis BL03诱变后突变株进行了初筛;再通过滤纸法观察透明圈、测定酶活力等方法复筛,确定了 2株正向突变株,并观察其基因稳定性。最终确定1株突变株B.subtilis BLAR1,20代传代培养后,CMC纤维素酶和漆酶活力分别为(U/mL):162.67、21.30,较B.subtilis BL03 分别提高 49.69%和 35.18%。将B.subtilis BLARl和BL03应用到园林绿化废弃物堆肥试验,并以黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)和未接菌剂的空白处理作为对照,在堆肥开始(0d)和堆肥30 d两次添加了堆肥菌剂。通过堆肥试验发现:①以CMC和苯胺蓝为底物筛选得到B.subtilis BL03在园林绿化废弃物堆肥中具有较好的木质素和纤维素降解能力,60 d堆肥较不加菌剂的空白对照,显著提高木质素降解率6.25%、纤维素降解率46.92%;②经ARTP诱变,获得的突变株B.subtilis BLAR1较B.subtilis BL03显著提高了纤维素降解能力10.5%,但木质素降解能力没有提高,与在实验室培养状态下酶活力提高的幅度有较大差距。利用Illumina Hiseq Xten,对B.subtilis BL03和BLAR1进行了全基因组分析,观察到该两菌在GO功能基因库方面的基因没有明显的区别。分析碳水化合物代谢相关的基因,发现B.subtilis BLAR1较BL03在碳水化合物酯酶基因方面增加了 1条CAZy基因数据库中EC10家族基因,该基因与乙酰木聚糖酯酶、肉桂酰酯酶、阿魏酸酯酶、羧酸酯酶、S-甲酰谷胱甘肽水解酶等酶相关,可能突变株酶活力增强与此有关,有待进—步验证和研究。为了便于菌剂产业化扩繁,研究获得了B.subtilis BLAR1工业级培养基配方(g/L):葡萄糖9.0、甜菜糖蜜15.0、玉米浆干粉20.0、黄豆饼粉20.0;最适培养温度为37℃、在恒温振荡器的培养最经济转速是200 rpm、最适初始生长pH范围是5.5-6.5,培养周期24h。将上述实验室扩繁参数与菌剂工厂的实践经验相结合,提出了菌剂生产工艺手册——《堆肥菌剂B.subtilis BLAR1扩繁工艺手册》,详见附录A。B.subtilis BLAR1所产CMC纤维素酶和漆酶最大积累时间度分别为48 h和60 h;酶活力最适pH都是6.0-9.0;最适温度是30-50℃,这些特性有利于该菌酶系在园林绿化废弃物堆肥中发挥作用。在酶诱导剂试验中,发现微晶纤维素和玉米芯对B.subtilis BLAR1产CMC纤维素酶有显著的诱导作用,而玉米秸秆和麦麸没有诱导作用;愈创木酚、香兰素、DL-苯丙氨酸对B.subtilis BLAR1产漆酶没有诱导效果。鉴于B.subtilis BLAR1最适生长温度在37℃,而所产CMC纤维素酶和漆酶活力最适温度都是30-50℃,为了提高该菌在园林绿化废弃物堆肥中使用效果,建议在环境达到30℃堆肥时使用,加入堆肥后菌剂中微生物会快速繁殖,高温期结束后,温度降到40℃附近再次添加菌剂,促进堆体腐熟。