第一部分荧光定量PCR法检测胃癌微转移可行性研究目的：探讨荧光定量PCR法检测胃癌微转移的敏感性和特异性。方法：1.选取5种不同分化程度的胃癌细胞株作为研究对象,将高分化细胞株AGS的表达量设定为1.0,RT-PCR法检测不同胃癌细胞株CK20表达情况,挑选出适合建立体外胃癌微转移模型的胃癌细胞株。2.应用10倍稀释法和毛细管法分别将10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、1个SGC-7901细胞株置入健康人10⁸外周血单核细胞中,建成含不同SGC-7901细胞数的体外胃癌微转移模型。3.分别采集40例健康志愿者外周血各两管,每管5ml。应用荧光定量PCR法分别检测健康志愿者两管外周血中及体外胃癌微转移模型中CK20mRNA表达情况以确定其检测胃癌微转移敏感性和特异性。结果：1.CK20mRNA在不同分化胃癌细胞株中均有表达,其表达强度在各胃癌细胞株之间差异无统计学意义（t=1.734,P=0.181）,而在PBMN中未能检测到CK20mRNA有效表达。在各胃癌细胞株中,SGC-7901表达相对偏低,故体外模型验证中选择SGC-7901细胞。2.对SGC-7901体外微转移模型检测显示,荧光定量PCR检测CK20mRNA微转移敏感性为10^-7。3.健康志愿者第一管血标本中,CK20荧光定量PCR检测9例为阳性,31例阴性,假阳性率为22.5%,而第二管血标本中,1例阳性,39例阴性,假阳性率2.5%。结论：1.CK20在不同分化胃癌细胞株中均有表达,而在PBMN中不表达。2.荧光定量PCR法检测胃癌外周血微转移的敏感性为10^-7,特异性为97.5%,是检测胃癌微转移较好的检测方法。第二部分 胃癌组织中CK20的表达及意义目的：研究胃癌组织及正常胃粘膜组织中CK20表达情况,分析胃癌组织中CK20表达与患者预后关系。方法：1.应用免疫组化法检测了85例胃癌患者肿瘤组织及胃粘膜组织中CK20表达情况。2.对比CK20在胃癌组织及胃粘膜组织中表达差异。3.对胃癌组织及胃粘膜组织中CK20免疫组化积分进行ROC检验,获得CK20免疫组化积分的cut-off值。4.根据胃癌组织中CK20免疫组化积分及cut-off值将患者分为CK20高表达组和低表达组,以Kaplan-Meier生存函数分析胃癌组织中CK20表达与患者无复发生存及3年总生存的影响。结果：1.CK20在胃癌组织、胃粘膜组织均不同程度阳性表达。2.胃癌组织中CK20免疫组化积分与胃粘膜组织中CK20免疫组化积分差异无统计学意义（P=0.107）3.至本研究结束,所有患者随访3年,胃癌组织中CK20低表达者与高表达者两组OS及DFS差异无统计学意义（P>0.05）。结论：1.CK20在胃癌组织、胃粘膜组织均普遍阳性表达。2.CK20在胃癌组织及胃粘膜组织中表达无明显差异。3.胃癌组织中CK20表达水平对患者OS及DFS无影响。4.CK20可以作为检测胃癌外周血、胃周淋巴结微转移的标记物。第三部分 胃癌患者外周血中CK20mRNA检测及意义目的：探索应用荧光定量PCR法检测胃癌患者外周血中CK20mRNA表达的临床意义。方法：1.应用荧光定量PCR法分别检测了85例胃癌患者、40例良性肿瘤患者手术前及手术后外周血中CK20mRNA表达情况。2.分析胃癌患者外周血中CK20mRNA阳性表达与临床病理参数之间的关系以及手术前后检测结果之间差异。3.应用Kaplan-Meier生存函数,分析胃癌患者术后外周血中CK20mRNA表达对胃癌术后无复发生存及3年总生存的影响。结果：1.手术前对照组40例良性肿瘤患者外周血中CK20mRNA检测结果均为阴性；85例原发性胃癌患者中有35例（41.2%）外周血中CK20mRNA阳性；两组之间差异有显著性(x²=22.876,P=-1.72×10^-6)。2.胃癌患者术前外周血微转移与患者年龄、性别、肿瘤位置无关（P>0.05）；与肿瘤分化程度相关（P<0.05）,与肿瘤大小、Borrmann分型、肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况、外周血CEA、CA724、CA199值、脉管内有无癌栓等病理特征密切相关（P<0.01）。3.手术后第一天,对照组40例良性肿瘤患者外周血中CK20mRNA检测结果仍均为阴性；85例原发性胃癌患者中有49例（57.6%）外周血中CK20mRNA阳性,两组之间差异有显著性(x²=37.926,P=7.34×10^-10)。胃癌患者手术后外周血中CK20mRNA表达与患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤分化程度无关（P>0.05）；与肿瘤大小、Borrmann分型、肿瘤浸润深度、胃周淋巴结转移情况、外周血CEA、CA724、CA199值、脉管内有无癌栓等病理特征密切相关（P<0.01）。4.手术后患者外周血CK20mRNA表达明显高于术前,两者差异有统计学意义（x²=4.612,P=0.032）。5.术后患者外周血CK20mRNA表达与患者术后OS、DFS相关（P<0.05）,阳性表达者的3年总生存时间及无复发生存时间均显著缩短。结论1.CK20mRNA在胃癌患者外周血中表达有较高的特异性。2.较多患者术前外周血存在微转移。3.胃癌患者术前外周血微转移与肿瘤体积大、分化差、Borrmann分型Ⅲ-Ⅳ型、浸润深度T3-T4、淋巴结转移N2-N3、术前外周血中CEA、CA724、CA199升高、肿瘤组织脉管内癌栓等因素相关。4.手术操作是促进胃癌微转移的一个重要因素。5.术后患者外周血中CK20表达可以评估患者预后。第四部分 CK20蛋白及基因在胃周淋巴结中的表达及其临床意义目的：通过对胃癌患者胃周淋巴结进行微转移检测,评价胃癌淋巴结微转移的检测方法,分析胃周淋巴结微转移危险因素以及微转移对患者预后的影响。方法：1.对胃癌患者胃周淋巴结进行HE常规检查、CK20免疫组化及CK20mRNA荧光定量PCR检测。2.应用Kaplan-Meier生存函数,分析各种检测方式证实的淋巴结转移对患者预后的影响。3.分析各临床病理参数与胃周淋巴结微转移之间关系。4.建立COX风险预测模型,分析基线资料及临床病理资料对胃癌患者预后的影响。结果：1.HE染色转移阳性淋巴结行免疫组化及荧光定量PCR检测均为阳性。2.HE染色阴性淋巴结行CK20免疫组化法检测发现有28枚/16例阳性；CK20mRNA荧光定量PCR检测发现有137枚/34例胃周淋巴结阳性,并且免疫组化检测呈阳性的荧光定量PCR法检测同时均为阳性。在胃周淋巴结微转移检测中,荧光定量PCR法灵敏度更高,与HE染色法比较采用x²检验,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.经免疫组化法和荧光定量PCR发现有137枚/34例胃周淋巴结存在微转移现象,导致22例患者的临床病理分期发生相应改变,使得胃癌临床病理分期更趋准确。4.胃周淋巴结微转移与患者年龄、性别、肿瘤位置、HE检查淋巴结转移情况无关（P>0.05）；与肿瘤大小、Borrmann分型、外周血CEA、CA724、CA199值、外周血微转移情况相关（P<0.05）；与肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度、肿瘤脉管内有无癌栓等临床病理参数密切相关（P<0.01）。5.存在胃周淋巴结转移和微转移的患者3年总生存时间及无复发生存时间明显低于无微转移的患者（P<0.05）。6.COX模型统计分析显示肿瘤分化、Bormann分型、浸润深度、脉管内癌栓、淋巴结转移及微转移、外周血微转移是影响胃癌预后的危险因素。结论：1.荧光定量PCR检测CK20mRNA表达,是发现胃癌胃周淋巴结微转移的灵敏检测方法。2.通过胃周淋巴微转移检测可以整体提高胃癌患者淋巴结转移的检出率,为患者提供更准确的术后病理分期。3.胃周淋巴结微转移与患者预后有明显相关性,微转移阳性的患者具有比较高的转移复发机率和死亡率。4.胃周淋巴结微转移是胃癌预后的危险因素,是评估胃癌预后比较独立的检测指标。