本研究旨在探讨应用神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)基因修饰的雪旺细胞(Schwanncells，SCs)与NT-3受体TrkC基因修饰的骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，MSCs)联合移植治疗大鼠脊髓全横断损伤，观察这种治疗策略能否更好地促进受损伤的脊髓结构与功能修复，并分析其中可能的修复机制，为临床上治疗急性脊髓损伤提供新的治疗策略和实验依据。 本研究分为以下三部分： (一)体外NT-3基因修饰雪旺细胞和TrkC基因修饰骨髓间充质干细胞共培养促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞 目的：探讨NT-3基因修饰的SCs和TrkC基因修饰的MSCs共培养对MSCs分化为神经元样细胞的影响。 方法：扩增，纯化重组腺病毒，并检测病毒的滴度；培养纯化MSCs和SCs；利用不同MOI值的AdvLacZ体外进行转染MSCs，计算出AdvLacZ在MSCs中的转染效率，并从中选择最合适的MOI值，利用不同MOI值的AdvGFP体外进行转染SCs，可计算出AdvGFP在SCs中的转染效率，并从中选择最合适的MOI值；分别用腺病毒载体介导的NT-3基因和TrkC基因转染SCs和MSCs，用ELISA法检测SCs内NT-3的分泌，用免疫组化检测MSCs内TrkC的表达；体外分为MSCs组、MSCs+SCs组、MSCs+NT-3-SCs组、TrkC-MSCs组、TrkC-MSCs+SCs组、TrkC-MSCs+NT-3-SCs组和LacZ-MSCs+LacZ-SCs组，7d后观察MSCs的分化情况，用巢蛋白(nestin)、β微管蛋白III(β-tubulinIII)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、突触后膜致密区蛋白(PSD95)等抗体免疫荧光组织化学染色，鉴定MSCs分化的细胞表型。 结果：1.通过腺病毒的扩增和纯化，获得了高滴度的lacZ基因、NT-3基因和TrkC基因的重组腺病毒。2.MSCs和SCs最适感染剂量分别是300和100。3.ELISA结果显示，NT-3-SCs培养液中NT-3的含量明显高于lacZ-SCs和未基因修饰的SCs。4.在培养7d后观察，体外培养的MSCs经与SCs共培养后能分化为神经元样细胞，这些细胞能够表达MAP2和PSD95等神经元标记物，而不表达星形胶质细胞标记物GFAP。在TrkC-MSCs+NT-3-SCs组，MSCs分化为神经元样细胞的百分率(32.9％)明显高于其它组。 结论：NT-3基因修饰的SCs和TrkC基因修饰的MSCs共培养能够促进MSCs向具有形成突触潜能的神经元样细胞分化。 (二)PLGA三维支架内NT-3基因修饰雪旺细胞和TrkC基因修饰骨髓间充质干细胞共培养促进骨髓间充质干细胞分化为具有形成突触潜能的神经元样细胞 目的：探讨PLGA三维支架内NT-3基因修饰的SCs和TrkC基因修饰的MSCs共培养对MSCs分化为神经元样细胞的影响。 方法：选P3～P5代MSCs，在体外分别种植于纳米纤维支架-聚L-乳酸(PLLA)，7孔聚乳酸/聚乙醇酸共聚物(PLGA)和16孔PLGA中，用扫描电镜、荧光显微镜观察细胞形态及MTT等技术检测细胞活力与生长情况。同时，将NT-3基因修饰的SCs和TrkC基因修饰的MSCs种植在16孔PLGA支架内，用免疫荧光组织化学染色检测MSCs内TrkC基因和SCs内NT-3基因的表达，并进一步用Westernblot检测TrkC-MSCs组内TrkC基因的表达。将细胞种植在16孔PLGA三维支架7d后，观察MSCs分化的情况。本实验分为MSCs组、MSCs+SCs组、MSCs+NT-3-SCs组、TrkC-MSCs组、TrkC-MSCs+SCs组、TrkC-MSCs+NT-3-SCs组和LacZ-MSCs+LacZ-SCs组，用nestin、β-tubulinIII、MAP2、PSD95、GFAP等抗体免疫细胞化学染色鉴定已分化的细胞表型；用Westernblot进一步检测β-tubulinIII的表达；同时将含细胞的PLGA支架固定，借助电镜观察PLGA支架内MSCs的分化情况。 结果：1.在扫描电镜和荧光显微镜下，均可以观察到MSCs在各种支架内存活与生长，其中在PLGA支架的细胞数量多，且分布较均匀。2.MTT检测结果显示，MSCs在16孔PLGA支架内生长活力最好。3.种植在PLGA支架的TrkC-MSCs和NT-3-SCs分别显示TrkC和NT-3阳性表达。4.在TrkC-MSCs与NT3-SCs组，种植在PLGA支架的MSCs分化为神经元样细胞的的百分率(46.42％)明显高于其它组，且比共培养(TrkC-MSCs+NT3-SCs)在二维孔板内的MSCs分化为神经元样细胞的百分率更高。5.电镜下观察到，NT-3-SCs+TrkC-MSCs组的神经元样细胞间有突触样结构形成。 结论：在PLGA三维支架内，NT-3基因修饰SCs和TrkC基因修饰MSCs共培养能够促进MSCs向具有形成突触潜能的神经元样细胞分化，与二维孔板共培养相比，MSCs分化为神经元样细胞的百分率有所提高。 (三)NT-3基因修饰雪旺细胞和TrkC基因修饰骨髓间充质干细胞联合移植促进大鼠全横断脊髓损伤结构和功能修复的实验研究 目的：探讨NT-3基因修饰SCs与TrkC基因修饰MSCs联合移植对大鼠全横断脊髓损伤结构和功能修复的影响。 方法：88只SD大鼠分为11组，正常对照组、实验对照组、MSCs组、MSCs+SCs组、LacZ-MSCs+LacZ-SCs组、MSCs+NT-3-SCs组、TrkC-MSCs组、TrkC-MSCs+SCs组、TrkC-MSCs+NT-3-SCs组、SCs组和NT-3-SCs组。暴露大鼠胸10脊髓段做全横断损伤，其中实验对照组在损伤处移植PLGA。其它实验组移植相应的细胞-PLGA复合体。术后动物存活60d，然后进行BBB评分、爬网格测试。再重新暴露胸11脊髓段，在离横断处下方1个脊髓节段处注射荧光金(FG)后再让动物存活7d。另一些动物在大脑皮质注射BDA后再存活14d。动物被检测体感诱发电位和脊髓诱发电位后，灌注固定、取材，进行组织切片和免疫荧光组织化学染色等形态学检测。 结果：1.体内实验2个月后发现，各组动物移植在脊髓损伤处的MSCs能够存活和迁移。2.移植在脊髓损伤处的基因修饰MSCs和SCs，均能表达外源基因产物。3.与其它移植组相比，在TrkC-MSCs+NT-3-SCs组中，移植的MSCs分化为MAP2、PSD95及MOSP阳性细胞的百分率明显增高，能更好地促进MSCs分化为具有形成突触潜能神经元样细胞以及少突胶质样细胞。4.在各细胞移植组中，脊髓损伤区内均可观察到CGRP、GAP-43、5-HT及NF-200阳性神经纤维。在TrkC-MSCs+NT-3-SCs组，这些阳性神经纤维的数量明显增多。这表明NT-3基因修饰SCs与TrkC基因修饰MSCs联合移植能明显促进神经纤维再生。5.实验对照组在距离脊髓损伤处较远头侧组织有BDA标记神经纤维，一些移植组在距离脊髓损伤处较近头侧组织能观察到BDA标记的神经纤维，在TrkC-MSC+NT-3-SCs组，可观察到BDA标记神经纤维延伸到脊髓损伤处。一些移植组的中脑红核及大脑皮质体感运动区内椎体细胞层有少量FG标记神经元，而在TrkC-MSCs+NT-3-SCs组，这两个部位的FG标记神经元较为明显。6.与其它移植组相比，TrkC-MSCs+NT-3一SCs组2个月后脊髓损伤区及损伤与宿主交界处MBP阳性髓鞘断面增加；脊髓损伤处CSPGs表达减少，而laminin表达增加。7.与其它移植组相比，TrkC-MSCs+NT-3-SCs组脊髓损伤后大鼠宿主神经元的存活数量(大脑皮质体感运动区内锥体细胞层、中脑红核和脊髓背核)明显增加。8.与其它移植组比较，TrkC-MSCs+NT-3-SCs组的体感诱发电位和脊髓诱发电位潜伏期缩短，峰峰值增高，BBB评分值也是明显增高。 结论：NT-3基因修饰SCs与TrkC基因修饰MSCs联合移植能更好地促进大鼠受损伤脊髓结构和功能的修复。