研究背景在女性生殖系统中,卵巢癌是致死率最高,发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌,高居第三位的恶性肿瘤。其起病隐匿,因腹水、腹胀、纳差发现时病灶多已发生转移,大多已属临床晚期。卵巢癌临床上治疗多以肿瘤细胞减灭术并辅助铂类、紫杉醇为主的联合化疗为主。虽然卵巢癌患者对铂类药物为基础的联合化疗,初次敏感反应率可达80%以上,但极易发生铂类耐药。多数患者终因化疗耐药而导致病情复发、死亡。因此,降低患者复发率,逆转卵巢癌化疗耐药,尤其是铂类耐药的发生机制及逆转途径已经成为目前重要的研究课题。近年来,对于肿瘤耐药机制的研究取得了重大进展,目前耐药机制研究主要包括耐药蛋白的表达增多,细胞内蛋白酶水平变化引起的细胞解毒功能增强,DNA损伤修复能力增强,靶分子水平的改变等等。聚酰苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly-ADPribosepolymerase-1,PARP-1)是 PARP 家族成员之一,其在体内含量最多也最具特异性,存在于真核细胞中,属于蛋白翻译后修饰酶。近来,其在肿瘤发生及侵袭转移中的作用越来越引起研究者的重视。PARP-1的分子量为116KDa,包含1014个氨基酸,位于染色体1q41～42区,包含有23个外显子。它能够通过碱基切除修复方式,对单股DNA进行损伤修复,在DNA的甲基化修饰和转录、细胞信号传导、细胞周期调控及细胞的有丝分裂等过程中发挥重要作用。许多研究发现,在维持基因组的稳定性方面PARP1的作用至关重要,抑制其活性可能使机体细胞对DNA损伤因子易感而发生肿瘤。而我们大量的前期试验也证实PARP1在卵巢癌中的表达增高,参与卵巢癌的发生。卵巢癌组织中vimentin、Snail表达与PARP-1表达呈正相关,PARP-1可能通过调控E-cadherin、vimentinu、Snail表达参与卵巢癌的转移、侵袭过程。研究表明PARP1在肿瘤细胞的基因修复、凋亡、增殖分化及侵袭转移中发挥重要作用,而通过抑制其活性,可以抑制由其介导的DNA损伤修复机制,增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性。目前PARP1抑制剂已应用于临床并在联合放化疗的治疗研究中取得重要进展,能够明显增强多种抗肿瘤药物的敏感性。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一类由19-23个核苷酸构成的,小分子内源性非编码单链RNA,由VictorAmbros,GaryRuvkun两位科学家发现,主要参与基因转录后调控。它可以介导调控细胞的增殖、凋亡、代谢等一些转录后基因表达的生理和病理生物学过程。近年来大量研究证明,miRNAs调控人类大约1/3编码蛋白的基因,且在多种肿瘤中异常表达,推测miRNAs可能主要通过直接调控目标基因的表达,参与了恶性肿瘤发病、进展及侵袭转移过程,与肿瘤的诊断和预后有着密切的关系。而其单核苷酸多态性(SNP)也与肿瘤耐药性有关,因此miRNAs可能成为肿瘤治疗新的靶点。MiRNA-216b是新近发现的miRNA,研究显示其在不同的恶性肿瘤中发挥不同作用。①miRNA-216b直接作用于FoxM1抑制胶质细胞增殖和侵袭。FoxM1在许多恶性肿瘤中表达增高,特异性表达于增殖细胞中,与细胞的生长密切相关,是Fox家族中转录因子成员,主要通过抑制细胞周期依赖性激酶抑制剂和参与生长激素介导细胞增殖。②miRNA-216b可能通过调控PBK而成为肿瘤抑制因子。PBK(PDZ结合蛋白)是一种能够调控药物在体内转运的蛋白质,在多种肿瘤的耐药机制中发挥作用。③外源性转染入乳腺癌细胞株的miRNA-216b能够抑制SDCBP的表达,从而降低细胞的增殖、迁徙和侵袭 ④MiRNA-216b可调控UDP木糖醇转移酶2B(UGT2B)的表达和活性。UGT2B是肝脏对内源性及外源性复合物解毒的重要辅酶,它可以帮助肝脏代谢各种激素、药物及致癌物质。而最新的研究表明,对UGT2B的调控是诱导肝脏癌变的重要机制。对miRNA-216b在肝癌中的研究表明,靶向抑制癌基因KRAS及其下游AKT/ERK信号通路是其发挥抑癌作用的主要途径。而miRNA-216b可以作为肝癌早期诊断及判断其术后预后的一个重要的分子标志。尽管目前还没有关于miRNA-216b特异性与卵巢癌化疗耐药相关的报道,鉴于抑癌基因参与多种肿瘤的化疗耐药,并结合miRNA作用机制,我们考虑其可能与卵巢癌化疗耐药有关并参与其作用机制。本文作了进一步研究。第一部分miRNA-216b对卵巢癌细胞SKOV3及耐药细胞株SKOV3/CDDP铂类耐药性的影响研究目的:研究miRNA-216b在卵巢癌细胞株SKOV3及其耐药细胞株SKOV3/CDDP中的表达及其对铂类耐药性的影响研究方法1.荧光实时定量PCR检测mmiRNA-216b在卵巢癌细胞株SKOV3及其耐药株SKOV3/CDDP中的表达;2.CCK-8法检测卵巢癌细胞株SKOV3及其耐药株SKOV3/CDDP活性,分析miRNA-216b表达与卵巢癌细胞株生存活性的关系;3.稳定转染miRNA-216b 后,CCK-8 法检测细胞株 SKOV3/CDDP/miR-216b与对照组细胞SKOV3/CDDP/miR-NC增殖的差异;4.流式细胞技术检测稳定表达miRNA-216b细胞株SKOV3/CDDP/miR-216b 与对照组细胞 SKOV3/CDDP/miR-NC 凋亡变化。结果1.与细胞株SKOV3相比较,miRNA-216b在SKOV3/CDDP细胞株中的表达显著降低,差别有统计学意义;2.在不同浓度的顺铂中,SKOV3/CDDP细胞株活性显著高于卵巢癌细胞株SKOV3;3.miRNA-216b对卵巢癌细胞株化疗敏感性的影响(1)给予稳定表达miRNA-216b的细胞株SKOV3/CDDP/miR-216b不同浓度顺铂处理,与对照组相比,细胞增殖显著减少,差别有统计学意义。(2)给予稳定表达miRNA-216b的细胞株SKOV3/CDDP/miR-216b不同浓度顺铂处理,与对照组相比,细胞凋亡显著增加,差别有统计学意义。结论:miRNA-216b参与调控卵巢癌细胞的铂类耐药。第二部分miRNA-216b通过调控PARP-1逆转卵巢癌耐药细胞株SKOV3/CDDP铂类耐药性的体外试验研究研究目的:研究miRNA-216b对PARP1的调控作用,探讨miRNA-216b调控卵巢癌铂类耐药的分子机制。研究方法1.生物信息学分析筛选卵巢癌耐药相关的候选基因;Real-time PCR确定候选基因在卵巢癌细胞株SKOV3及其耐药细胞株SKOV3/CDDP中表达变化;2.荧光实时定量PCR检测卵巢癌组织中miRNA-216b及PARP1的表达,分析二者表达的相关性;3.双荧光素酶报告基因检测法检测miRNA-216b与PARP1的相互作用;4.再将购自Origene的PARP-1质粒,再转染入稳筛的卵巢癌细胞株SKOV3/CDDP/miR-2]6b 及 SKOV3/CDDP/miR-NC,weston blot 观察转染后PARP1在蛋白水平的表达变化,CCK-8、流式细胞技术检测细胞株SKOV3/CDDP/miR-216b增殖及凋亡的变化。结果1.生物信息学分析筛选ACOX1、BIN1、RHOH和PARP1四个候选基因;Real-time PCR显示只有PARP1在miRNA-216b过表达的细胞系中明显降低;2.上皮性卵巢癌组织中PARP1与miRNA-216b的表达具有负相关性;3.双荧光素酶报告基因检测显示miR-216b能够抑制PARP1的转录活性,对PARP1突变体的转录活性无影响;4.PARP1质粒转染组PARP1蛋白表达增加,SKOV3/CDDP/miR-216b细胞株PARP1转染后对铂类耐药性增加,细胞活性增加,凋亡减少。结论:miR-216b在体外能够通过降低PARP-1的表达,逆转卵巢癌细胞SKOV3/CDDP对铂类的耐药。第三部分miR-216b调控PARP1逆转卵巢癌顺铂耐药的体内实验研究研究目的:构建人卵巢癌顺铂耐药裸鼠移植瘤模型,通过体内实验,进一步探讨miR-216b靶向调控抑制PARP1逆转上皮性卵巢癌顺铂耐药的作用机制。研究方法1.构建裸鼠人卵巢癌顺铂耐药移植瘤模型共选取40只4周龄雄性cd-1/cd-1裸鼠为实验的对象(BALB/c裸鼠、CD-1裸鼠均可用于肿瘤学研究和肿瘤移植;CD-1裸鼠肿瘤细胞接种量一般大于10?7以上,其接种量相对于BALB/C裸鼠较大,而且其成瘤的速度较之于BALB/c裸鼠慢1-2周),随机盲法分为2组,分别取稳定表达miR-216b的对数生长期细胞株 SKOV3/CDDP/miR-216b 及阴性对照细胞株 SKOV3/CDDP/miR-NC,10μL/只,调整细胞密度1X107/100μL,注射于裸鼠两侧协皮下。2.顺铂经腹腔注射治疗裸鼠皮下移植瘤并观察其生长情况裸鼠皮下注射两种细胞后,分为2组:SKOV3/CDDP/miR-216b组和SKOV3/CDDP/miR-NC组,每组20只。7d左右可见皮下移植瘤,10d左右待皮下移植瘤直径约5mm开始行腹腔内注射顺铂5mg/kg,每周2次,持续4周。自注射顺铂开始每3d测量1次皮下移植瘤的大小,即分别于种植皮下移植瘤的第10、13、16、19、22d,每次每组随机盲选4只,提取移植瘤,测量移植瘤大小,通过求取其中3只平均数,进而绘制生长曲线,移植瘤体积(mm3)=0.5*长(mm)*宽 2(mm2)。3.Western Blotting法检测两组移植瘤中PARP1的表达差异分别将两组所提取的所有瘤组织,每200mg瘤组织加入蛋白裂解液1mL,分别提取两组的总蛋白,测蛋白浓度后,通过Weston blotting检测观察两组瘤组织中PARP1的表达差异。结果1.成功构建了裸鼠的人卵巢癌顺铂耐药移植瘤模型一般成功接种卵巢癌细胞3d左右皮丘消失,7d左右可见皮下移植瘤形成,成瘤率可达100%。2.miR-216b体内逆转卵巢癌细胞SKOV3/CDDP的顺铂耐药裸鼠皮下注射两种细胞后,分为2组:SKOV3/CDDP/miR-216b组和SKOV3/CDDP/miR-NC组,每组20只。7d左右可见皮下移植瘤,10d开始行腹腔内注射顺铂5mg/kg,每周2次,持续4周。同时分别于种植皮下移植瘤的第10、13、16、19、22d,每次每组随机盲选4只,提取移植瘤,测量移植瘤大小,求取其中3只平均数,进而绘制生长曲线,移植瘤体积(mm3)=0.5*长(mm)*宽2(mm2)。可见顺铂治疗期间SKOV3/CDDP/miR-216b组的裸鼠皮下移植瘤与对照组SKOV3/CDDP/miR-NC相比生长显著较慢,移植瘤体积显著较小,质量显著较轻。对各组间裸鼠皮下移植瘤体积之间的差异进行统计学分析,结果显示顺铂治疗后的第3、6、9、12d的SKOV3/CDDP/miR-216b组皮下移植瘤的体积要显著小于SKOV3/CDDP/miR-NC组皮下移植瘤体积,差别有统计学意义。SKOV3/CDDP/miR-216b组皮下移植瘤的平均质量显著低于SKOV3/CDDP/miR-NC组皮下移植瘤的质量,差别有统计学意义。3.SKOV3/CDDP/miR-216b组皮下移植瘤内PARP1蛋白表达减低分别用 SKOV3/CDDP/miR-216b 组及 SKOV3/CDDP/miR-NC 组皮下移植瘤组织提取总蛋白,通过weston blot试验检测PARP1蛋白的表达情况。我们发现与 SKOV3/CDDP/miR-NC 组移植瘤相比,在 SKOV3/CDDP/miR-216b 组的瘤组织中,PARP1蛋白表达水平显著降低。结论:miR-216b可通过靶向下调PARP1基因有效逆转裸鼠上皮性卵巢癌皮下移植瘤的顺铂耐药。总结:本研究表明,在顺铂耐药卵巢癌细胞SKOV3/CDDP中,miR-216b的表达较之于其在野生株卵巢癌细胞SKOV3中的表达显著降低;miR-216b能够显著增加卵巢癌耐药细胞对顺铂的药物敏感性。我们研究发现,在不同浓度梯度顺铂干预的情况下,miR-216b能够显著降低顺铂耐药卵巢癌细胞SKOV3/CDDP的生存活力,促进其凋亡。miR-216b的这一作用可能是通过直接与PARP1的3’UTR结合,调控PARP1的表达发挥作用。这一结果在卵巢癌组织样本和裸鼠体内同样得到了验证。因此,miR-216b/PARP1能够作为卵巢癌临床诊断及治疗的一个潜在靶标。