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凝集素是一类含有至少一个糖基特异性识别结合结构域的非免疫原性蛋白。凝集素在自然界中广泛存在,具有多种生物学活性,例如免疫调节,抗肿瘤,抗菌等活性。同时,凝集素特异的糖识别结合特性,也使其成为糖生物学研究的重要工具。所以新型凝集素的发现对于肿瘤等疾病药物的筛选以及糖生物学的发展是非常必要的。在本论文研究中,我们一方面从北虫草子实体中分离鉴定了一种新型的北虫草（Cordyceps militaris）来源凝集素CMIP,研究了其结构组成,糖结合特异性,免疫调节以及抗肿瘤活性。同时我们也克隆与原核表达了另外两个虫草活性蛋白ConA-like lectin（CMCL）和 Recin-B related lectin（CMRBL）,研究了其凝血,抗肿瘤和丝裂原活性。另一发面,我们根据二聚化的凝集素Di-AAL2特异性结合GlcNAc结尾的糖的特性,将Di-AAL2弱亲和层析和HCD/ETD-LC-MS/MS质谱联合应用于鉴定蛋白质的O-GlcNAc修饰。同时也对O-GlcNA特异性抗体CTD110.6用于O-GlcNAc修饰的富集做了初步探究。1.虫草凝集素CMIP的分离、鉴定和克隆:用多级分子筛层析的方法从北虫草子实体中分离得到一种新型的北虫草凝集素CMIP。通过LC-MS/MS质谱检测,鉴定到该凝集素的肽指纹图谱。图谱比对到北虫草转录组数据库,得到凝集素CMIP的编码基因CCM01955。我们克隆了 CCM01955基因,并且原核表达了重组的CMIP蛋白。圆二色谱结果显示,CMIP主要以β折叠的二级结构形式存在。通过美国糖功能组学研究中心第5.2版本的糖芯片检测CMIP的糖结合特性,结果显示CMIP对以核心五糖为骨架的,带有polylactosamin结构的糖有特异性结合。在细胞结合检测中,CMIP对免疫类型细胞（Jurkat,RAW264.7和Raji细胞）有较好的结合,而对其他检测的多种肿瘤细胞结合比较弱（4T1,HeLa<5%,MCF-7,H22<10%,HepG2<16%）。并且CMIP对Jurkat细胞的结合不能被其他类型的凝集素（ConA,WGA,AAL,AAL2,LCA,Galectin-1）封闭,说明CMIP与被检测的几种常用凝集素的结合配体完全不同。对人外周血淋巴细胞结合实验表明CMIP对CD8T淋巴细胞有特异性结合（结合比率为68.5%）,而对CD4T淋巴细胞结合非常弱（结合比率为10.3%）。因CMIP对免疫类细胞（T细胞,B细胞,巨噬细胞）有特异性的结合,我们重点检测了 CMIP的免疫调节活性。结果发现1)CMIP可以有效刺激脾脏来源的淋巴细胞的增殖;2)CMIP可以特异性激活巨噬细胞M1型分化。我们进一步研究了 CMIP诱导巨噬细胞细胞活化机理,结果表明,CMIP激活巨噬细胞表面CD86分子的表达,以及激活巨噬细胞M1型分化细胞因子（如IL-1β,iNOS,CXCL-11,CCL2等）的表达,并且CMIP与IFN-y联合使用对诱导巨噬细胞M1分化有协同增效作用。蛋白免疫印迹检测发现STAT1和p38的磷酸化激活参与CMIP诱导巨噬细胞M1型分化的过程。由于CMIP具有很好的免疫调节活性,我们检测了这种免疫调节活性在抗肿瘤中的效应。我们用小鼠乳腺癌肺转移模型,检测了 CMIP的抗肿瘤活性,发现CMIP不仅能够有效抑制肿瘤细胞的肺部转移和生长,并且可以显著地延长荷瘤小鼠的生存周期。体外细胞毒性实验检测表明,CMIP不能结合到肿瘤细胞4T1表面,也对肿瘤细胞没有任何毒性作用。该模型进一步说明CMIP是通过免疫调节活性起到抗肿瘤转移和生长作用的。2.虫草活性蛋白CMCL,CMRBL的克隆和纯化:从北虫草基因组数据库中,我们筛选了两个子实体来源的基因CCM03227,CCM03832,编码的蛋白序列分别具有ConA-like的糖结合区域和Ricin B-like的糖结合区域。设计引物,对这两基因进行克隆和表达纯化,将表达的蛋白分别命名为 CMCL（Cordyceps militaris ConA-like lectin）和 CMRBL（Cordyceps militaris RicinB related lectin）。凝血实验表明CMRBL是一种新凝集素,可以特异性凝集大鼠血红细胞,可能具有糖结合活性,值得进一步研究。但是对于检测的几种血红细胞,CMCL没有凝集效果;细胞毒性检测,CMCL和CMRBL对HeLa和HepG2的增殖没有抑制效应,但可以有效促进脾脏淋巴细胞的增殖。3.杨树菇来源的二聚化凝集素Di-AAL2在O-GlcNAc修饰鉴定中的应用:凝集素弱亲和层析与HCD/ETD-LC-MS/MS质谱联用应用于大鼠糖尿病组织中O-GlcNAc修饰蛋白的鉴定。肌肉细胞胰岛素敏感模型中用O-GlcNAc检测抗体CTD110.6以及RL2检测,发现胰岛素刺激可以提高细胞O-GlcNAc修饰水平。在棕榈酸诱导的胰岛素耐受细胞模型中,胰岛素刺激引起的O-GlcNAc的上升被抑制。在体内糖尿病模型中,我们用佐链脲菌素诱导SD大鼠糖尿病模型,取其肝脏和心脏组织作为材料,进行组织蛋白O-GlcNAc修饰的鉴定。组织蛋白胰酶酶解后,用其他糖结合特异性的凝集素去除N-连接的糖肽,然后用PNGaseF酶切,切去残留的N-糖连接糖肽的N-糖,最后用POROS AL-Di-AAL2柱子对O-GlcNAc修饰肽段进行富集或者用O-GlcNAc广谱抗体CTD110.6超滤管的方法对修饰肽段进行富集,然后HCD/ETD-LC-MS/MS质谱检测,最终对鉴定到的图谱进行手动验证O-GlcNAc氧鎓离子特征峰。一共在糖尿病大鼠肝脏中鉴定到44个修饰蛋白,50个修饰肽段,65个修饰位点。在糖尿病大鼠心脏中鉴定到32个修饰蛋白,35个修饰肽段,40个修饰位点。最后对鉴定到的两个蛋白ERP44和PPP1R12A进行IP验证,发现这两个蛋白确实发生O-GlcNAc修饰,而且与正常大鼠相比,在糖尿病组织中修饰水平更高。