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背景和目的:MicroRNA(miRNA)是一类大小约22nt的非编码RNAs,通过抑制靶mRNA的翻译或降解靶mRNA在转录后水平调节靶标基因的表达,从而参与细胞增殖、分化、凋亡等过程。有研究表明miRNA在间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向脂肪细胞及成骨细胞分化过程中起到重要作用。本研究以miR-20a为对象探讨其对脂肪细胞分化的作用,预测并鉴定其靶基因,阐明miR-20a促进脂肪细胞分化的机制。方法:1.分离并培养小鼠骨髓MSCs,分别对其进行脂肪细胞及成骨细胞诱导分化,基因芯片技术检测miRNA在诱导成脂及成骨分化过程中的差异表达。并利用Real Time PCR检测几种不同前体细胞向脂肪细胞和成骨细胞分化过程中miR-20a的表达变化。2.对前脂肪细胞系3T3-L1转染miR-20a mimics及miR-20a inhibitor并对细胞进行诱导,利用Real Time PCR、Western Blotting和油红O染色等技术观察miR-20a对3T3-L1细胞成脂分化的影响。构建表达miR-20a前体的慢病毒感染3T3-L1细胞,检测过表达miR-20a的慢病毒对3T3-L1细胞成脂分化的影响。3.利用靶基因预测软件对miR-20a的靶基因进行预测,构建表达靶基因3’UTR的荧光素酶报告基因载体,利用荧光素酶报告基因技术鉴定靶基因。构建敲减靶基因表达的慢病毒,观察抑制靶基因表达对3T3-L1细胞分化的影响,探讨miR-20a调节脂肪细胞分化的分子机制。结果:1.基因芯片结果显示miR-17家族在小鼠骨髓MSCs向脂肪细胞分化过程中表达升高,在MSCs向成骨细胞分化过程中变化不明显。进一步研究显示miR-20a在C3H10T1/2与3T3-L1细胞诱导成脂后表达上升,在ST2细胞诱导成骨早期表达下降,晚期升高。这些提示miR-20a可能参与调控脂肪细胞和成骨细胞分化。2.转染miR-20amimics后,3T3-L1细胞成脂特异性基因aP2、PPARγ、C/EBPα和C/EBPβ的表达均上调,细胞分化成熟;miR-20a过表达慢病毒亦可促进3T3-L1细胞向脂肪细胞分化。而转染miR-20a inhibitor则与上述结果相反,表明miR-20a促进了 3T3-L1细胞向脂肪细胞分化。3.生物信息学及已有文献预测Tcf4、Bmp2、Smad5和PPARy为miR-20a的潜在靶基因。双荧光素酶报告基因检测显示,miR-20a过表达载体与Tcf4 3’UTR荧光素酶报告基因质粒共转染293-AD细胞后荧光素酶活性显著下降,但miR-20a不能结合Bmp2、Smad5和PPARy的3’UTR。随后经定点诱变获得了 Tcf4 3’UTR "应答序列"的缺失突变体,将此突变体或其野生型质粒与miR-20a过表达载体共转染后,发现miR-20a不能抑制突变体荧光素酶活性。证实miR-20a能与Tcf4的3’UTR上预测靶位点有效结合,发挥抑制效应。为了进一步证实Tcf4在成脂分化中的作用,我们构建了敲减Tcf4表达的慢病毒,发现抑制Tcf4表达可以促进3T3-L1细胞aP2、PPARγ、C/EBPα和C/EBPβ的表达,促进细胞分化成熟。这些结果证实miR-20a促进3T3-L1前脂肪细胞分化成熟,其作用机制是通过靶向结合Tcf4 3’UTR而阻断其翻译实现的。结论:1.miR-20a在小鼠脂肪细胞分化过程中显著上调,在成骨细胞分化过程中下调。2.miR-20a促进3T3-L1细胞向脂肪细胞分化。3.Tcf4是miR-20a的靶基因,Tcf4在脂肪细胞分化中具有重要作用,为脂肪细胞分化的负性调控因子,miR-20a通过靶向抑制Tcf4表达而促进脂肪细胞分化。