【摘 要】
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牛奶中含有丰富的蛋白质、脂肪、糖、氨基酸、矿物质、维生素和人体必需的其他营养成分。奶牛乳腺作为乳汁合成、分泌和贮藏的唯一场所,决定着牛奶的产量和质量。在不同的泌乳时期,乳腺的基因表达水平不同,牛奶中乳脂的含量也不同。牛奶中脂肪的主要成分是甘油三酯(Triglycerides,TAG),其在乳脂中占有98%-99%。甘油三酯分子由一个的甘油分子和三个脂肪酸分子脱水缩合而成,长链脂酰辅酶A合成酶 4(
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牛奶中含有丰富的蛋白质、脂肪、糖、氨基酸、矿物质、维生素和人体必需的其他营养成分。奶牛乳腺作为乳汁合成、分泌和贮藏的唯一场所,决定着牛奶的产量和质量。在不同的泌乳时期,乳腺的基因表达水平不同,牛奶中乳脂的含量也不同。牛奶中脂肪的主要成分是甘油三酯(Triglycerides,TAG),其在乳脂中占有98%-99%。甘油三酯分子由一个的甘油分子和三个脂肪酸分子脱水缩合而成,长链脂酰辅酶A合成酶 4(long-chain acyl-CoA synthetase 4,ACSL4)是 ACSL 家族成员之一,是脂质合成过程中的关键酶,主要催化C12～C22长链脂肪酸为长链脂酰CoA。然而,该基因在奶牛乳腺上皮细胞中的研究极少。本研究对荷斯坦牛泌乳中后期的乳腺组织进行转录组测序,在转录水平揭示了荷斯坦牛泌乳中后期的基因表达变化,研究发现,与乳脂合成相关的PPAR信号通路在泌乳后期发生显著变化(P<0.05),且该通路中ACSL4在泌乳后期表达水平上调(P<0.05)。因此,本研究根据NCBI中的牛ACSL4基因序列,在其保守区设计特异性引物,以荷斯坦奶牛乳腺组织为cDNA模板克隆ACSL4基因;对克隆得到的基因进行序列分析,使用预测软件PSORT Prediction预测蛋白的亚细胞定位;构建pcDNA3.1+-ACSL4真核表达载体并转染到奶牛乳腺上皮细胞中表达;使用siRNA对奶牛乳腺上皮细胞中ACSL4的表达量进行抑制;测定细胞中甘油三酯含量和脂质合成相关基因的表达量的变化。试验结果显示:(1)与泌乳中期相比,在荷斯坦牛泌乳后期乳腺组织中共发现470个差异表达基因,其中266个下调,204个上调,其中ACSL4在泌乳后期显著上调(P<0.05);(2)KEGG分析结果显示,与乳脂合成相关的PPAR信号通路在泌乳后期显著变化(P<0.05);(3)牛ACSL4基因开放阅读框全长2136 bp,编码711个氨基酸,其中正电荷残基为89个,负电荷残基为77个,编码蛋白整体带有正电荷,分子质量为79261.10,理论等电点为8.71。ACSL4编码区在不同品种间高度保守,且由其编码的蛋白主要在内质网膜上发挥作用;(4)在奶牛乳腺上皮细胞中过表达ACSL4,甘油三酯含量显著上升(P<0.05),且PABP3、ELOVL6表达量显著上调(P<0.05),ACSL1、PPARD、FASN、FADS2,CPT1A表达量变化不明显(P>0.05);(5)在奶牛乳腺上皮细胞中被抑制ACSL4,甘油三酯含量显著下降(P<0.05),且ACSL1、PABP3、CPT1A、ELOVL6、FASN表达量显著下调(P<0.05);F4DS2、PPARD表达量变化不明显(P>0.05)。试验结果揭示了荷斯坦牛在泌乳中后期转录的变化水平和ACSL4对乳腺上皮细胞中甘油三酯表达水平变化的影响。
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