人源隐孢子虫动物模型的建立与隐孢子虫种系发育关系分析

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隐孢子虫病是一种重要的人兽共患的原虫病,目前尚无用于治疗隐孢子虫病的特效药物。线粒体是真核生物中拥有蛋白和酶最多的细胞器,因而隐孢子虫线粒体也可能成为药物潜在的作用靶位。最近一些研究表明隐孢子虫存在线粒体诱生的细胞器,但和其他原生动物的线粒体存在着差异。隐孢子虫具有退化的线粒体,但缺少线粒体基因组,完全依赖核基因来编码所需的功能蛋白。 1.为了评价两种常用免疫抑制方法对小白鼠排卵囊规律的影响。作者将19日龄小白鼠随机分成两组,第一组通过饮水给予地塞米松,第二组采用导胃管灌服地塞米松。第3天,两组中每只小白鼠灌胃接种人源隐孢子虫,每只小白鼠感染量为1.5×10~6个卵囊。结果:两组均在感染的当天就有卵囊排出,感染后第6天粪便卵囊计数明显增加,随之出现3个高峰期,此后逐渐下降。免疫抑制组小白鼠在卵囊持续期不断有死亡但无腹泻症状。结论:用这两种免疫抑制方法,均能成功感染人源隐孢子虫,但通过灌服地塞米松可使小白鼠获得更高的OPG(每克粪便中的卵囊数)值和更长的排卵囊持续期。 2.为了近一步了解人源隐孢子虫在小白鼠体内的内生发育情况。作者采用19日龄昆明系小白鼠作为模型动物,随机分成8组,分3个感染剂量进行人源隐孢子虫分离株感染系列筛选试验,并确定随剂量和时间不同对人源隐孢子虫在小白鼠寄生部位的影响。感染后于4H、8H、12H、48H、72H破杀高剂量组。4D、6D、9D、12D,16D,20D破杀中剂量组。取每只小白鼠的消化道和其他脏器用福尔马林固定,作组织切片观察人源隐孢子虫在小白鼠体内的寄生部位和内生发育情况。结果表明隐孢子虫主要寄生在小白鼠十二指肠、空肠和回肠。在感染早期主要寄生在空肠和回肠,在感染中后期主要寄生在十二指肠和空肠。 3.为了从分子上了解本试验室所分离到隐孢子虫株所属的种或基因型,作者对所分离到隐孢子虫种株进行PCR扩增18SrRNA基因全序列和HSP70基因序列,并对PCR扩增片段进行测序,然后利用Clustal X、DNAstar和Paup等软件对其进行序列分析比较、构建分子进化树,试图从分子上证明河南省不同地区不同种类隐孢子虫的遗传特征,以阐明隐孢子虫病的分子流行病学特点。通过18SrRNA基因全序列和HSP70序列分析,河南人源隐孢子虫分离株为小球隐孢子虫鼠基因型;河南鹿源隐孢子虫分离株不同与小球隐孢子虫鹿基因型;河南猪源隐孢子虫的两个分离株均为小球隐孢子虫猪基因型,即猪隐孢子虫;河南鹌鹑源的隐孢子虫两个分离株分别为贝氏隐孢子虫和火鸡隐孢子虫;河南乌鸡隐孢子虫和鸵鸟隐孢子虫分离株均为贝氏隐孢子虫;河南牛源隐孢子虫分离株为安氏隐孢子虫。 4.本试验以核编码的线粒体功能性蛋白基因Cpn60,AOX和PNO作为研究对象,对实验室分离到隐孢子虫分离株进行扩增测序,以确定在动物源隐孢子虫线粒体相关基因是否存在,对扩增出的序列进行比对分析构建进化树,以确定不同隐孢子虫株之间的进化关系,并与18SrRNA基因和HSP70基因构建的进化树作对照,进而评价这些基因是否更适合作为隐孢子虫分类和进化关系的基因座。结果通过CPN60、AOX和PNO基因编码序列构建进化树也同样适于作为隐孢子虫种系发育分析。
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