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目的:通过观察脂多糖(LPS)诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)M1/M2亚型极化,同时从单层细胞通透性和细胞迁移愈合能力两个方面观察不同炎症状态下的巨噬细胞对小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)屏障功能的影响。初步探讨T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3/半乳糖凝集素-9(Tim-3/Gal-9)信号通路在LPS诱导的巨噬细胞表型及功能调节中的意义及分子机制。方法:体外培养原代BMDMs和小鼠PMVECs,用0.1 mg/L的LPS分别刺激BMDMs 0、1、3、6、12、24h,流式细胞术检测CD86、CD206,western-blot法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arg-1)等巨噬细胞分型标记物以分析不同处理组的巨噬细胞M1/M2表型差异,激光共聚焦-免疫荧光法观察BMDMs中Tim-3和Gal-9共定位,免疫共沉淀法检测Tim-3和Gal-9结合程度。将不同处理组的BMDMs分别与PMVECs共培养,伊文思兰渗漏法检测单层PMVECs渗透性变化,细胞划痕实验检测PMVECs的迁移愈合能力。另取BMDMs并分为空白对照组、α-乳糖(a-lactose)处理组,Tim-3 封闭抗体(Tim-3 mAb)处理组,LPS+a-lactose处理组,LPS+Tim-3 mAb处理组(在LPS刺激前1 h用含40μmol/L Gal-9信号拮抗剂α-lactose或10mg/L的Tim-3 mAb的无血清DMEM进行预处理,后LPS处理3 h),通过封闭Tim-3或Gal-9信号以验证Tim-3/Gal-9在巨噬细胞亚型极化及屏障功能调节中的作用。结果:1.M1型巨噬细胞占比在LPS刺激后6 h、12 h、24 h显著增加,其标志物iNOS的表达刺激后持续上调(均P<0.01);而M2型巨噬细胞占比和其标志物Arg-1表达显著上调,并于3h达到峰值(与Oh组比较,P<0.01);随后M2型巨噬细胞占比逐渐降低至0 h水平,其标志物Arg-1表达在12 h和24 h低于Oh水平(均P<0.01)。2.短期LPS刺激(1 h、3h)的BMDMs可以增加PMVECs的迁移能力(与Oh组比较,1h组P<0.05,3h组P<0.01),降低单层细胞的通透性(均P<0.01),长期LPS刺激(12 h、24h)的BMDMs可抑制PMVECs的迁移能力,显著上调了单层细胞的通透性(均P<0.01)。3.经LPS刺激后,巨噬细胞内Tim-3/Gal-9蛋白表达及Tim-3和Gal-9的结合较空白对照组明显上调;并在3 h达到峰值,之后随刺激时间延长而逐渐下降(均P<0.01)。4.与 LPS(3 h)处理组相比,LPS(3 h)+α-lactose组和LPS(3 h)+Tim-3mAb组中M1型巨噬细胞占比(均P<0.01)和其标志物iNOS表达(LPS+α-lactose组P<0.05;LPS+Tim-3mAb组P<0.01)均显著增加,而M2型巨噬细胞占比(LPS+α-lactose 组 P<0.05;LPS+Tim-3mAb 组 P<0.01)和其标志物 Arg-1(P<0.01)表达均明显下降。5.与 LPS(3 h)处理组相比,LPS(3h)+α-lactose组和LPS(3 h)+Tim-3mAb组的BMDMs均下调了与其共培养的PMVECs的迁移能力,并上调了其单层通透性(均P<0.01)。同时,Tim-3和Gal-9信号封闭也可下调胞内Tim-3和Gal-9的蛋白表达及相互结合能力(均P<0.01)。结论:LPS对巨噬细胞极化和功能的影响具有双向性,并通过Tim-3/Gal-9信号通路介导。短时LPS刺激可上调Tim-3/Gal-9信号,抑制巨噬细胞向M1亚型极化,从而发挥屏障保护作用;长时LPS刺激可下调Tim-3/Gal-9信号,促进巨噬细胞向M1亚型极化,从而破坏屏障功能。