研究背景：　　毛囊主要由上皮和真皮两部分结构组成，上皮部分的外根鞘（Outer root sheath，ORS）包含隆突部-毛囊干细胞所在地，而真皮部的毛乳头(Dermal papilla，DP)则是维持毛囊周期、诱导毛发再生的重要结构。哺乳动物通常不具备很强的组织和器官再生能力，但是，毛囊却是一个特例，它是哺乳动物体内少数能够自我再生的微型器官。实验已经证实，切割后的部分毛囊片段可以再生出新的毛囊单位。事实上，毛囊，尤其是大鼠触须毛囊，是一个研究器官再生的非常好的对象，因为第一：大鼠触须毛囊非常容易获取；第二：毛囊结构相对简单，易于观察；第三：毛囊的胚胎发育和生长均涉及真皮与表皮间复杂的作用网络，即毛囊内部同时存在多条信号通路，这一特点有利于研究真皮-表皮之间、多种信号通路间的相互作用机制；第四：毛囊的生长具有典型的周期性特征，按顺序可分为生长期（anagen）、退行期（catagen）和休止期（telogen），各时期的信号分子的作用机制截然不同，这为研究各信号通路的作用机制提供了极好的模型。以往的研究已经表明，Wnt/β-catenin信号在毛囊胚胎发生以及出生后毛囊周期的维持、毛囊再生中，都发挥着不可或缺的作用，一旦Wnt/β-catenin信号通路被阻断，则会严重影响甚至中断毛囊的形态发生。在毛囊周期性的生长中，Wnt10b和Wnt5a蛋白通过Wnt/β-catenin经典信号通路发挥完全相反的调控作用，前者促进毛囊生长而后者则抑制毛囊生长。大量的研究还表明Wnt/β-catenin信号通路在肝脏、肺和皮肤等器官损伤后的再生修复过程中发挥关键性作用。许多研究结果都证实Wnt/β-catenin信号通路是调控器官再生的重要信号通路，由此可以猜想：Wnt/β-catenin信号通路和毛囊片段再生必然有着密不可分的联系。为了验证我们的猜想，我们决定从毛囊片段再生过程中的Wnt/β-catenin信号通路入手，结合干细胞标记物和PCNA的时空表达和蛋白变化情况，探寻调控毛囊片段再生的真正“奥秘”，试图为器官再生研究提供新的线索和依据。　　目的：　　(1)分离生长期大鼠触须毛囊，研究大鼠触须毛囊中Wnt/β-catenin信号通路分子、毛囊干细胞标志分子、DP和DS特异性标志分子α-SMA的表达定位。　　(2)构建毛囊上段体内再生模型，研究毛囊这个迷你器官再生的新方法和机制。　　(3)揭示Wnt/β-catenin信号通路在毛囊片段再生过程中的作用，重点揭示Wnt10b和Wnt5a分子与触须毛囊上段再生的关系。　　方法：　　(1)钝性分离SD大鼠触须毛囊，然后挑选处于生长期的毛囊进行冰冻切片,HE染色观察毛囊的组织结构。用荧光免疫组化技术（IF）检测Wnt/β-catenin信号通路分子、毛囊干细胞标记分子、DP和DS特异性分子α-SMA、PCNA在毛囊中的表达模式。　　(2)构建毛囊上段再生模型：挑选生长期触须毛囊，沿毛球部上方切除毛球部，将获得的毛囊上段群体移植至裸鼠背部皮下，最后在不同时间点分别取材，HE染色观察球部再生过程中毛囊内部结构变化情况，尤其是毛囊下端的变化情况。　　(3)将大鼠触须毛囊上段移植到裸鼠皮下，动物随机分成三组：　　实验组：分别在第5、6、7、8、9、10、11、12天注射DKK1到裸鼠皮下的毛囊移植点，注射剂量为40ng/点/次。　　PBS对照组：用PBS代替实验组的DKK1，移植方法和注射方法同实验组。　　空白对照组：只进行毛囊上段移植和取材。　　(4)空白对照组移植后第5，9，15，26天分别取材，冰冻切片后，用TUNEI法检测毛囊内部细胞凋亡情况，用IF检测β-catenin、LEF1、TCF3、Wnt10b、Wnt5a等在毛囊再生过程中的表达情况。移植后第5，9，15，26天提取毛囊总蛋白，Western Blot技术检测β-catenin、TCF3、Wnt10b、Wnt5a、CK15、CD34和PCNA的蛋白表达水平。　　(5) PBS对照组和实验组移植后第5，9，15，26天分别取材，制作石蜡切片，HE染色观察两组毛囊再生情况，比较移植后第26天两组毛囊再生率。提取移植后第9天两组毛囊总蛋白，Western Blot检测并比较两组毛囊中相关分子的蛋白表达水平。　　结果：　　(1)大鼠触须毛囊体积较大，肉眼易于分辨，镜下特征明显：一般包含两根毛发，毛干（hair shaft）和杵状毛（club shaft）。生长期毛囊内部Wnt/β-catenin信号通路异常活跃，Wnt10b、Wnt5a、β-catenin、LEF1、TCF3、CK15、CD34、α-SMA和PCNA均广泛地表达于整个毛囊的各个部位。　　(2)毛囊上段移植后第5天,ORS细胞大量增殖并填充了拔除毛发遗留的空腔，并且有部分ORS细胞已经突出到玻璃膜(glassy membrane，GM)底部切缘之外。到第9天，ORS细胞和DS细胞继续增殖，部分DS细胞已经移动到底部ORS中，初级DP正在形成。移植后第15天,大鼠毛囊的球部结构已经基本形成，新的毛发也已经长出。到移植后第26天，毛囊再生已经完成，其形态已经接近于正常毛囊。移植后第26天，多个移植点皮肤长出细长的触须样毛发纤维。取材时可见毛囊已经再生出新的毛球部，毛球部形态与正常触须毛囊非常相似。　　(3) Western Blot结果显示，毛囊片段移植后Wnt10b分子的表达水平逐渐增高，表达的部位主要位于毛囊底部切缘附近的ORS和DS处，从第9天到第26天,Wnt10b在底部DS细胞中的表达逐渐增强。Wnt5a的变化情况不同于Wnt10b,其第9天表达水平略微低于第5天，随后又开始小幅度升高。Wnt5a在底部DS的表达一直低于ORS。　　(4) Western Blot结果显示β-catenin在毛囊上段再生过程中表达水平逐渐增高，从第5天到第9天升高最为明显，在第5，9天时主要表达在ORS处，到第15时才开始微弱地表达在新生的DP。至第26天时，在新生的DP和毛母（matrix）中均高水平表达。LEF1和TCF3的表达模式不同，在毛囊片段再生过程中，LEF1的表达区域却似乎呈现逐渐减小的趋势，毛囊再生初期LEF1大量表达在断端附近的ORS和DS部位，到第26天时，则仅仅在matrix部位有表达。TCF3的表达模式不同于LEF1，随着毛囊再生的进行，其表达水平逐渐增高，表达区域也逐渐增大，第9天时开始出现在新生的DP之中，到第15天时强烈表达在新生的内根鞘（inner root sheath，IRS）中。毛囊再生过程中，CK15的蛋白水平一直增高，而PCNA的表达也一直升高，直到第15天达到最高，而后开始下降。　　(5)局部注射DKK1后，实验组毛囊片段再生受到抑制，毛囊再生率降低为33.3％，远远低于PBS对照组的83.3%。和PBS对照组相比，实验组毛囊的β-catenin、CK15和PCNA的表达水平都明显降低。　　结论：　　(1)大鼠生长期触须毛囊内部Wnt/β-catenin信号通路异常活跃，提示Wnt/β-catenin信号通路与毛囊周期性生长具有密不可分的关系。　　(2)触须毛囊上段再生模型的可靠性高、稳定性强、重复性好，可以作为研究组织和器官再生的良好平台。　　(3)在毛囊器官再生过程中，β-catenin表达水平逐渐升高，证实Wnt/β-catenin信号通路参与并且调控了毛囊再生的过程。　　(4) Wnt10b激活经典Wnt信号通路，对毛囊再生过程中发挥正性的调节作用，而Wnt5a则会抑制经典Wnt信号通路，发挥了负性调节作用。　　(5) DKK1可通过阻断经典Wnt/β-catenin信号通路，降低毛囊上段再生率，说明DKK1是一个毛囊组织器官再生的负性调节因子。