论文部分内容阅读
本课题组从自然界分离得到一株高产多糖菌株,经鉴定命名为Enterobacter cloacaeZ0206。前期在实验室环境条件下,初步建立了20206多糖的发酵条件参数,并初步揭示Z0206多糖不仅具有免疫调节、抗氧化功能,而且具有降血糖、特别是降血脂功能。为了建立一套适用于工业化生产的Z0206多糖发酵工艺,并进一步阐明Z0206多糖对高脂日粮诱导下机体脂代谢紊乱的缓解作用及机制,本研究以玉米淀粉、豆粕粉、玉米浆干粉等为发酵原料,采用单因素试验、正交试验及响应面设计对Z0206多糖的工业化发酵条件及培养基组成进行了优化；结合离子交换色谱、凝胶渗透色谱等现代分离技术获得Z0206多糖的主要组分,并通过红外光谱、高效液相色谱、气相色谱、核磁共振、原子力显微镜等现代仪器分析手段初步解析了Z0206多糖主要组分的化学组成及结构；再以高脂诱导的C57BL/6肥胖小鼠和TNF-a刺激的3T3-L1小鼠脂肪细胞为模型,研究了Z0206多糖对高脂诱导肥胖小鼠脂代谢紊乱的缓解作用及初步分子机制。主要结果如下：试验一.Z0206多糖产业化发酵条件建立及培养基组成优化本试验选择能够进行产业化生产的玉米淀粉、豆粕粉、玉米浆干粉等为主要发酵原料对Z0206多糖的发酵条件和发酵培养基组成进行了筛选和优化。在多糖的发酵条件优化方面,采用单因素试验优化了Z0206多糖的发酵温度、发酵转速和初始pH值,结果表明：Z0206多糖发酵的最佳温度为30℃、转速为250rpm、初始pH值为7.0。在发酵培养基组成优化方面,首先采用单因素试验对发酵培养基成分进行了筛选,结果表明：以玉米淀粉为Z0206多糖工业化生产的碳源,以豆粕粉、玉米浆干粉和KN03为复合氮源,以CaCl2、K2HPO43H2O及KH2PO4为无机盐组成；采用正交试验设计优化了培养基中无机盐浓度,结果表明：当CaCl2,1g/L; K2HPO43H2O,3g/L; KH2PO4,3g/L时多糖产量最高；根据Box-Benhnken中心组合设计原理,以Z0206多糖产量为响应值,设计三因素三水平的响应面试验,优化了Z0206多糖发酵的最佳碳氮、源浓度为：玉米淀粉,240.95g/L；豆粕粉,22.19g/L；玉米浆干粉,6.61g/L。在以上优化条件下Z0206多糖的产量可达27.75g/L,是前期多糖产量的2倍以上。试验二.Z0206多糖的分离纯化、化学组成及结构的初步分析在优化了Z0206多糖发酵条件和培养基组成的基础上,进一步对发酵获得的Z0206多糖进行了分离纯化、化学组成及结构分析。在Z0206多糖的分离纯化方面,本试验结合Sevage和酶法脱蛋白,20%H2O2脱色,透析和冷冻干燥获得Z0206脱蛋白多糖(EPS)；并采用DEAE-52离子交换柱层析和Superose12凝胶色谱层析对EPS进行分离纯化,获得EPS-1和EPS-3两个主要多糖组分,得率分别为40.8%和26.7%。在此基础上,采用凝胶渗透色谱、气相色谱、液相色谱及化学方法对以上两个组分的化学组成进行了分析,结果显示：EPS-1的相对分子质量为2527Da,是仅由葡萄糖组成的中性糖；EPS-3的相对分子质量为1.23x106Da,是由岩澡糖、半乳糖、葡萄糖、丙酮酸和糖醛酸组成的酸性糖,摩尔质量比为1.65：1.83：1：1.62：1.20。采用红外光谱仪、核磁共振仪、原子力显微镜和激光粒度仪对两个组分的结构进行了初步分析,结果表明：EPS-1和EPS-3糖链中均含有-CH2-基团,并存在α和β两种糖苷键构型。除此之外,EPS-3糖链中还存在糖醛酸、丙酮酸和岩澡糖单元；EPS-1的平均粒径为50.75nm,而EPS-3的平均粒径为210.3nm；在空间形貌上,EPS-1和EPS-3糖分子间均相互缠绕,聚集紧密成团,形成无规则排列的球状。以上结果综合表明,Z0206多糖由中性糖和酸性糖组分构成,化学组成包括葡萄糖、半乳糖、岩澡糖,以及丙酮酸和糖醛酸单元；Z0206多糖链存在α和β两种糖苷键构型,在空间上呈现无规则排列的球状结构。试验三.Z0206多糖缓解高脂诱导肥胖小鼠脂代谢紊乱的作用研究在优化了Z0206多糖的发酵条件及培养基组成,并初步分析了Z0206多糖化学组成及结构的基础上,本试验通过建立高脂日粮诱导形成的C57BL/6肥胖小鼠模型,从表型变化、血液生化指标、组织形态等多方面研究了Z0206粗多糖(CEPS)及其脱蛋白多糖(EPS)对高脂诱导肥胖小鼠脂代谢紊乱的缓解作用。试验选取6周龄的雄性C57BL/6小鼠,分为普通日粮组(ND)和高脂日粮组(HFD),分别给与普通饲料(10%脂肪含量,Kca1%)和高脂饲料(45%脂肪含量,Kcal%),连续饲喂12周直至两组的平均体重差异显著。再将饲喂高脂日粮的小鼠随机分为高脂组(HFD)、Z0206粗多糖组(HFD+CEPS)和Z0206脱蛋白多糖组(HFD+EPS),多糖组每天分别灌胃200mg/kg.BW两种多糖溶液(10mg/mL), ND组和HFD组每天灌胃等体积的生理盐水,连续灌胃42d。研究结果显示：与高脂日粮组相比,CEPS和EPS均可减缓小鼠增重,降低空腹血糖浓度和血清胰岛素水平,提高胰岛素敏感指数(ISI)及小鼠口服葡萄糖耐量(P<0.05),并降低肥胖小鼠肝脏指数,皮下脂肪、腹部脂肪及附睾周脂指数,表明CEPS和EPS能抑制高脂诱导的脂肪过度沉积,并提高小鼠的胰岛素敏感性；血清生化指标结果表明：CEPS和EPS能通过降低血清游离脂肪酸(FFA)含量(P<0.05)以及总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-c)的水平(P<0.05),并一定程度提高血清高密度脂蛋白(HDL-c)的水平,从而缓解高脂诱导的脂代谢紊乱现象；组织形态观察结果表明：CEPS和EPS均能通过缓解肥胖小鼠肝脏细胞的变形、肿胀、抑制脂滴形成,从而维护肝脏组织的结构完整性,缓解高脂诱导的肝脏脂肪变性；CEPS和EPS也能通过抑制肥胖小鼠附睾脂肪细胞过度增大,从而缓解高脂日粮导致的脂肪细胞肥大的现象；基因和蛋白检测结果显示：CEPS和EPS均能通过促进肥胖小鼠脂肪组织脂联素(Adiponectin)、内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(Vaspin)、Visftin等胰岛素敏感性因子的mRNA表达,降低瘦素(Leptin)、抵抗素(Resistin)等胰岛素抵抗因子的mRNA表达,同时激活过氧化物酶体增生物激活受体γ (PPARγ)表达,并提高胰岛素作用通路中Aktl的磷酸化水平、胰岛素受体底物1(IRS-1)和葡萄糖转运蛋白4(Glut4)的基因表达,从而增强肥胖小鼠脂肪组织的胰岛素敏感性,调节机体能量代谢水平。以上结果综合表明Z0206多糖能通过增强高脂诱导肥胖小鼠的葡萄糖摄取能力,缓解肝脏组织脂肪变性和脂肪组织过度肥大,从而缓解胰岛素抵抗；并通过调控脂肪因子表达和血脂平衡,维护机体脂代谢平衡,从而起到改善脂代谢紊乱的作用。试验四.Z0206多糖缓解脂代谢紊乱的免疫学机制研究在研究了Z0206多糖缓解高脂诱导的肥胖小鼠脂代谢紊乱作用的基础上,进一步从脂肪炎症的角度,采用免疫组化、流式细胞仪、荧光定量、Western blotting等技术探究了Z0206多糖缓解脂代谢紊乱的免疫学机制。脂肪组织巨噬细胞研究结果表明：CEPS和EPS均能通过减少附睾前脂肪组织中F4/80阳性细胞数量,降低CDllc+阳性细胞比例,同时减少巨噬细胞形成的"Crown like structure"数量,从而减少高脂诱导的脂肪组织巨噬细胞浸润；同时,CEPS和EPS均能通过上调M2型巨噬细胞标记基因CD209、CD163和Mg12的表达和下调M1型巨噬细胞标记基因F4/80、CD11c和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达,从而促进脂肪组织巨噬细胞由M1型向M2型分化；脂肪炎症因子表达方面,体内试验结果显示：CEPS和EPS均能提高附睾脂肪组织中抑炎细胞因子IL-10的表达,降低促炎细胞因子TNF-α、IL-6的表达；体外试验结果显示：Z0206多糖组分EPS-3同样能降低TNF-α刺激下3T3-L1小鼠脂肪细胞NO产生和促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的基因表达,并提高抑炎细胞因子IL-10的基因表达,由此表明Z0206多糖通过调控炎症因子的表达缓解了高脂诱导的脂肪炎症反应；基因及蛋白检测结果揭示：Z0206多糖可能通过下调脂肪细胞TLR4表达,降低IKBα磷酸化,抑制NF-κB活性,同时降低c-Jun氨基端激酶的磷酸化水平,从而缓解肥胖小鼠脂肪组织慢性低度炎症。以上结果综合表明Z0206多糖一方面可以通过减少高脂诱导肥胖小鼠脂肪组织巨噬细胞浸润,并促进巨噬细胞由M1型向M2型分化；另一方面,Z0206多糖可能通过抑制脂肪细胞TLR4/IκBαa/NF-κB途径和c-Jun途径,降低促炎细胞因子生成,从而缓解高脂诱导下的脂肪组织炎症,有效防止脂代谢紊乱的发生。