生物修复技术已发展成为高效、低成本、环境友好型的污染治理技术。在生物修复过程中,普遍采用生物强化即在污染场地接种经驯化的高效微生物来提高生物降解污染物的速率。但溢油污染海岸线生物修复是一项涉及污染场地特性、微生物生态结构及各种环境条件的复杂工程,所构建的石油烃降解菌群的组成及其对环境的适应性都会影响生物修复的过程。论文从筛选高效石油烃降解菌和构建具有协同代谢作用的混合菌群出发,利用传统生物技术手段和现代分子生物学手段,确定所构建的降解菌群在溢油污染不同海岸线生物修复中的作用,重点阐明修复过程中微生物数量和种群结构的变化,确定影响溢油污染生物修复的主要因素。以期为具有协同代谢作用的混合菌群的构建及应用生物强化手段提高溢油生物修复效率提供基础。主要内容有:1、在选育具有不同功能的石油烃降解菌的基础上,初步构建了对原油具有协同代谢作用的混合石油烃降解菌。(1)以天津港六号码头沉积物为菌源地,分别以渤西平台(BXPT)原油、正十六烷和多环芳烃为碳源,采用连续富集筛选的方法,得到具有不同功能的混合菌群:原油降解菌群BXHH-1、烷烃降解菌群ALK-1和芳烃降解菌群PAH-1。PCR-DGGE分析结果表明:以原油为碳源得到的混合菌群落最为丰富,且基本包括了以正构烷烃和多环芳烃为碳源富集得到混合菌。这表明以原油为碳源所得到的混合菌在群落组成和结构上都优于以正构烷烃和多环芳烃为碳源所得到的混合菌。(2)通过平板分离法,从以原油、烷烃和多环芳烃为碳源的富集液中各分离出2株菌,分别命名为TJ-1、TJ-2、TJL-1、TJL-2、DHD-1和DHX-1,经16SrDNA同源性鉴定,这6株菌分别为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilu)、威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)、Oceanobacillus Picturae、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)和皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)。其中,TJ-1、TJ-2、TJL-1和TJL-2为烷烃降解菌,DHD-1和DHX-1为芳烃降解菌。(3)以原油为碳源富集到的混合菌BXHH-1为基础,复配芳烃降解菌DHD-1和DHX-1,构建得到新的混合石油烃降解菌BXHH-2。与原混合菌BXHH-1相比,所构建的新混合菌BXHH-2不仅对烷烃具有良好的降解能力,并且大大提高了芳烃的降解能力,从而有效的提高了BXPT原油的总降解率。这表明该混合菌对原油中的多种组分的降解具有协同作用,因而在溢油污染的现场生物修复中具有良好的应用前景。2.初步确定了所构建的高效石油烃降解菌剂在不同溢油污染海岸线现场修复试验中的作用和使用条件。(1)通过比较不同类型海岸线(粗砂-鹅卵石海岸线、细-中砂海岸线和粉砂-淤泥海岸线)可以看出:同一基质不同处理中,同时添加缓释肥料和石油烃降解菌剂体系(A-3、B-3、C-3)的原油降解率最高,分别达到49.8%、66.9%和65.3%,比各自未处理的对照体系分别提高28.4%、28.0%和29.8%;其次为添加缓释肥料的体系,A-2、B-2和C-2试验池,其原油降解率分别为43.2%、56.8%和64.3%,比各自未处理的对照体系分别提高21.8%、17.9%和28.8%。同时添加缓释肥料和石油烃降解菌剂的体系所具有的高原油降解率,不仅是由于所添加的缓释肥料为土著石油烃降解菌的生长提供了较为充足的营养盐,还由于接种的高效石油烃降解菌能够很快适应现场环境,大量生长繁殖,改变生物修复系统中的微生物群落结构,从而有效的提高了各类石油烃组分的降解率。(2)对于粉砂-淤泥基质溢油污染海岸线,同时添加缓释肥料和石油烃降解菌剂的体系与只添加缓释肥料体系的原油降解率接近,分别达到65.3%和64.3%,比未处理的对照体系分别提高29.8%和28.8%。该基质中氮、磷营养盐的缺乏是限制其降解的主要因素,石油烃降解率的提高是由于缓释肥料的加入提供了土著微生物生长所需要的营养盐。接种的石油烃降解菌与土著菌相比,缺少竞争力而难以生长繁殖,也没有改变生物修复系统中的微生物群落结构。石油烃不同组分的降解主要是由土著微生物完成的。(3)不同类型的溢油污染岸线的现场生物修复试验中,温度、溶解氧和pH等都处在微生物生长的适宜范围内,不是限制生物修复效果的因素。