烧伤治疗的一个核心问题就是创面问题。对于大面积烧伤患者而言,及时有效地覆盖创面对于提高患者的生存率至关重要。采用自体皮肤移植是治疗皮肤缺损的传统办法,但这些植皮方法均不同程度地缺乏真皮成分,对愈后外观和功能存在较大的影响。真皮移植和理想真皮组织替代物的研制是皮肤组织工程研究人员的首要和重要任务。由于猪皮来源广泛,与人皮肤在结构和功能上有些相似,异种脱细胞真皮基质(ADM)通常由猪皮制备,并受到人们的广泛关注。但其在临床应用中仍存在着下列缺点:(1)免疫原性较强,局部长期存在炎症免疫反应;(2)现有的脱细胞真皮较致密,对营养的渗透性差,血管化速度慢,导致移植后存活率低。本研究针对目前异种ADM所存在的问题,首先在真皮动物来源种属选择上,探讨了猪真皮、大鼠真皮与人真皮组织学上的差异,为脱细胞真皮动物来源的选择提供实验依据;然后对现有的制备ADM的方法进行了改进研究,使脱细胞更彻底,免疫原性更低;在此基础上,通过兔皮下植入ADM的实验来评价ADM的体内生物相容性。最后,又进行了ADM复合肝素的初步研究,为复合型ADM的研制提供了初步的实验数据。目的1.通过比较研究巴马小型猪、SD大鼠与人皮肤在真皮组织结构、胶原类型和生物力学性能方面的差异,为脱细胞真皮动物来源的选择提供组织学上的实验依据。2.改良本实验室已有制作SD大鼠ADM的方法,并通过HE染色法评估其效果,通过兔皮下植入实验来评价ADM的体内生物相容性。3.探索将肝素和SD大鼠脱细胞真皮支架复合的简易方法,为临床推广应用创造条件。方法1.收集巴马小型猪、SD大鼠与人的背部全层皮肤样本,采用大体观察、HE染色、Masson三色染色、天狼猩红染色、VVG染色、扫描电镜及透射电镜等方法,显微照相后进行形态学观察和图像分析软件测量,同时利用材料试验机检测真皮生物力学性能。2.在酶消化法的基础上选取不同浓度和处理时间制备异种脱细胞真皮,HE染色法观察脱细胞效果;对比有无低渗处理的酶消化法加去污剂法制备的ADM的脱细胞效果,HE染色法观察并用图像分析软件测量计算脱细胞程度。3.新西兰大白兔随机分为4组,分别为A组:有基底膜DM组;B组:有基底膜ADM组;C组:无基底膜网状层ADM组;D组:假手术组。每组6只。在兔的脊背中线切2.0 cm切口,向切口两侧游离制备皮下囊,囊的大小为4 cm×2 cm,囊间距2 cm,每侧4个囊;然后将ADM剪成2 cm×2 cm大小的小片,植入皮下囊内。术后1周、2周、4周、8周和12周分别取出皮下埋藏的植入物,大体观察真皮周围组织有无明显炎症反应。真皮植入物样本用4%多聚甲醛固定,HE染色,光学显微镜下观察炎性细胞浸润。4.将ADM浸泡肝素溶液不同时间,并通过甲苯胺蓝分光光度法测量肝素含量,并与未脱细胞的DM比较。结果1.与人皮肤比较,光镜下可见巴马小型猪皮肤的真皮胶原纤维束更粗[(39.29±10.17) m vs (17.21±5.20) m] (P=0.0003),而其间隙率更低[(19.01±1.55)% vs (32.36±1.28)%] (P=0.029),SD大鼠的胶原纤维束稍粗[(19.27±0.36) m] (P=0.049),间隙率接近[(30.54±3.50)%] (P=0.049)。巴马小型猪真皮弹性纤维分布、Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量及其比值也与人真皮有明显差异(P<0.05),SD大鼠则与人真皮类似。2.扫描电镜显示巴马小型猪真皮的胶原纤维束排列紧密、束间孔隙小,而SD大鼠和人真皮胶原纤维束比较纤细,排列松散,束间散在大小不一的相互连通的孔隙;透射电镜显示巴马小型猪真皮的胶原原纤维较细,横纹的周期更长,而SD大鼠胶原原纤维较粗,横纹的周期相近。3.生物力学检测显示巴马小型猪真皮的最大应变[(0.52±0.05) mm/mm]低于人真皮[(0.80±0.06) mm/mm] (P=0.003),而弹性模量[(69.65±12.16) MPa]和最大应力[(20.72±1.49) MPa]高于人真皮[分别为(44.23±4.63) MPa、(11.85±0.19) MPa] (P=0.028,P=0.001),SD大鼠真皮的最大应变[(0.63±0.08) mm/mm]也低于人真皮(P=0.042);而弹性模量[(35.60±7.29) MPa] (P=0.158)和最大应力[(8.60±2.16) MPa] (P=0.120)与人真皮无明显差异。4.每1 cm×1 cm的真皮片加入2 ml的酶消化液所制备的ADM细胞成分残余少,作用2小时不会出现消化过度的情况。这个方案为酶消化法的最佳处理方案。联合低渗处理所制的ADM均未见细胞成分残余,而且纤维束完整,排列规则,达到了既去除细胞成分而又保持纤维三维结构的目的,与未增加低渗处理组比较,有明显的统计学差异(P=0.000)。5.与有基底膜的DM组比较,ADM组的动物大体观察均未见皮肤坏死的征象,其组织切片提示早期以单个核细胞侵入为主,术后2~3月,成纤维细胞与毛细血管逐渐长入植入物,未见明显的炎性与免疫排斥反应征象。6.大鼠真皮的肝素含量从脱细胞前的(4.34±0.83) g/cm2降为脱细胞后的(2.36±0.13) g/cm2 (P=0.000),脱细胞处理显著的降低了真皮的肝素含量。浸泡肝素后ADM的肝素含量,从浸泡15 min以后,其肝素含量[(4.25±0.77) g/cm2]就达到了未经酶消化的DM的肝素含量的水平,并以浸泡12小时为高峰[(8.43±1.43) g/cm2]。结论1.猪真皮在组织形态学方面与人真皮有较大差异,而SD大鼠的真皮却与人真皮有更多的相似之处,因此,以SD大鼠作为异种脱细胞真皮动物来源具有较为可靠的组织学依据。2.根据真皮组织的抗原性分布特点设计了去除基底膜的物理方法,在改良胰酶消化法的基础上结合低渗处理显著减低了异种真皮组织的免疫原性,植入体内仅见到轻微的炎症反应。3.脱细胞处理显著降低了真皮基质内的肝素含量,短时间浸泡肝素(15~30 min)就能使ADM恢复消化前肝素含量。这一异种ADM复合肝素的简易方法将为临床的推广应用创造条件。