金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）（Staphylococcus aureus,S.aureus）分布范围广泛,是社区和医院感染的常见致病菌之一,它能够分泌多种外毒素和酶类介导致病,其中凝固酶（Coagulase）是其重要的毒力因子之一,本实验室前期通过构建金葡菌转座子突变文库,筛选出与促凝集相关的泛醌细胞色素氧化酶A亚基基因（Cyd A）,并验证了Cyd A缺失后,细菌促血浆凝集能力显著降低。泛醌细胞色素氧化酶是原核生物中存在的呼吸链末端氧化酶,参与NADH分解代谢并为ATP的合成提供动力,在金葡菌有氧呼吸过程中发挥重要作用。研究目的:1.探究Cyd A对金葡菌Newman株能量代谢过程的影响。2.探讨Cyd A调控金葡菌Newman株血浆凝固酶表达的分子机制。研究方法:1.分别在常规气体及25℃、35℃、40℃等温度条件;6%CO2的气体条件及35℃,检测Newman野生株、Newman△cyd A株在对数生长期的ATP、NAD+的相对含量。2.通过转录组测序,检测对数生长期的Newman野生株、NewmanΔcyd A株基因组表达的变化,观察cyd A基因缺失对下游基因表达的影响,随后q RT-PCR验证关键基因表达是否一致。3.利用同源重组的方法构建金葡菌Newman株Δsae RS株、回补株Δsae RS::p RBsae RS和过表达株Δcyd A::p RBsae RS。4.采用血浆凝集试验,观察sae RS敲除和回补以及在Δcyd A内过表达后对金黄色葡萄球菌促血浆凝集能力的影响。5.鉴于sae RS是多种毒力因子的双组分调控系统,采用溶血试验、生物膜形成等实验对该基因的调节功能进行了进一步验证,同时也证实了cyd A可下调sae RS表达而影响血浆凝固酶的形成。研究结果:1.在常规气体及25℃、35℃、40℃,6%CO2及35℃培养条件下;NewmanΔcyd A中ATP含量较Newman野生株均无明显变化,而NAD+浓度则出现下降明显。2.转录组测序发现,Δcyd A与Newman野生株比较,共计出现了136个基因差异表达,其中上调表达基因48个,下调表达基因88个,差异表达基因主要集中于金葡菌的毒力、代谢、合成及信号传导等通路上。3.与Newman野生株相比,Sae RS敲除株不能使血浆凝集,回补株血浆凝集能力基本恢复,过表达株血浆凝集能力明显上升。4.敲除Sae RS与cyd A基因后,金葡菌溶血能力明显减弱,生物膜形成能力提高。研究结论1.Cyd A敲除后金葡菌能量代谢中间产物NAD+含量下降明显,提示Cyd A影响血浆凝聚是通过降低NAD+实现。2.Cyd A敲除后细菌促血浆凝集能力明显下降,调控机制是通过下调Sae RS导致促血浆凝聚基因表达降低有关。