神经胶质瘤是人类最常见的脑部肿瘤。目前,恶性胶质瘤的常规治疗手段(手术加放化疗)治疗困难、远期效果差,死亡率高。对于恶性程度高的胶质瘤患者,生存期短、5年生存率小于1％。怎样改善胶质瘤的治疗效果,是临床面对的一个难题。近年来,随着分子生物学、分子遗传学的研究进展,对于肿瘤的基因治疗方面取得了长足进步,为提高恶性胶质瘤的治疗效果,增加患者的生存率开拓了新的思路。　　 白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)是一个具有多种生物学活性的细胞因子。可激活T细胞、NK细胞,促使其产生INF-γ。研究证实,在T细胞或NK细胞存在的情况下,IL-18具有明显的抗肿瘤作用,而消除T细胞、NK细胞或INF-γ作用后,IL-18仍可诱导肿瘤细胞凋亡。研究表明,外源性IL-18基因能下调PCNA、cyclin D1、cyclin B1的表达,上调p21的表达,从而降低C6细胞的增殖能力和恶性程度。　　 MDR1基因表达产物P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp),是细胞膜上的跨膜蛋白,可在膜上形成药物通道,具有药泵功能,参与药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程,与肿瘤对化疗药物的敏感性密切相关。此外,P-gp可能具有抑制细胞死亡的作用。因此,P-gp的表达水平是影响病人术后化疗效果及生存时间的主要因素之一。本实验主要研究MDR1基因在C6/IL-18细胞系中的表达,并探讨其对化疗药物顺铂敏感性的影响。　　 目的:研究IL-18基因对大鼠C6胶质瘤细胞MDR1基因表达影响。　　 方法:　　 1.细胞培养:C6和C6/IL-18细胞,用RPMI1640培养基,内含10％胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml。37℃、饱和湿度、5％CO2环境下培养。　　 2.MTT法检测C6和C6/IL-18细胞对顺铂的敏感性:取对数生长期C6和C6/IL-18细胞,经0.04％EDTA消化后,加入培养液吹打混匀,以1.5×105/ml细胞浓度接种于96孔培养板,每孔加入180μl细胞悬液。24h后按照实验分组分别加入经生理盐水稀释的不同浓度的药物20μl,每组均做3个复孔。药物与细胞共同培养24h,每孔加入5mg/ml MTT20μl,继续孵育4小时后,离心弃上清,加入150μl/孔DMSO终止反应,振荡仪振荡10 min。用酶标仪在490nm波长下测吸光值(A值)。计算细胞抑制率和顺铂对两种细胞的半数抑制浓度(IC50)。本实验重复3次。　　 3.流式细胞术检测细胞凋亡:取对数生长期C6细胞和C6/IL-18细胞,加入IC50的CDDP作用24h后,0.04％EDTA消化、离心,用冷PBS洗两次,70％乙醇固定细胞24 h。上机前离心去乙醇,用PBS洗两次,加100μg/ml　　 RNnase37℃消化30 min。50μg/ml PI染色30 min。经尼龙网过滤后,用FACSTAR Calibur型流式细胞仪(Becton Dickinson,CA,USA)测定。同时用不加药的相应细胞为对照组。实验重复3次。　　 4.用RT-PCR法检测MDR1基因mRNA的表达情况,以β—actin为内参；检测两种细胞IL-18 mRNA的表达情况,作为旁证。根据核苷酸序列用Premier5.0软件设计MDR1和β-actin引物。然后,采用Trizol法提取C6和C6/IL-18细胞总RNA,取2μg细胞总RNA逆转录成cDNA(37℃60 min,95℃5min),取2μl逆转录产物进行PCR扩增。条件为95℃预变性10 min,95℃变性40 s,51℃退火40 s,72℃延伸40 s,共30个循环,72℃再延伸10 min,4℃保存。最后,PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳观察结果、照相,用凝胶。蛋白图像分析系统分析结果,分别计算C6和C6/IL-18细胞条带的积分光密度与相对的β-actin条带积分光密度的比值。实验重3次。　　 5.采用Western-Blot法检测P-gp表达情况,以β-actin为内参。用质膜蛋白抽提试剂盒,提取C6、C6/IL-18细胞的胞浆蛋白和膜蛋白,用考马斯亮蓝G250试剂盒检测抽提的蛋白浓度。每孔加入100μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,将靶蛋白从凝胶转移至硝酸纤维素(NC)膜。NC膜在5％脱脂奶粉中封闭1 h,加入小鼠一抗4℃过夜,然后与辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗37℃温育1 h,利用化学发光法进行显色反应,照相并用凝胶-蛋白图像分析系统测定各蛋白条带的积分光密度值,分别计算C6和C6/IL-18细胞条带与相对的β—actin条带积分光密度比值。实验重复3次。　　 6.实验数据以(x)±s表示,用SPSS13.0统计软件作单因素方差分析(One-Way ANOVA),取P<0.05为有显著性意义。　　 结果:　　 1.顺铂作用24h后,C6细胞160、80、40、20、10、5、2.5、0.5μg/ml顺铂组的细胞抑制率是54.26±3.08％、52.92±4.18％、49.20±4.34％、41.40±5.19％、32.35±5.34％、20.69±5.40％、14.27±4.77％、9.20±5.32％；C6/IL-18细胞的相应抑制率分别是69.86±3.82％、65.27±3.72％、60.94±3.37％、53.94±4.81％、40.37±4.72％、29.93±4.68％、20.85±5.08％、8.27±4.61％。C6/IL-18细胞对顺铂的敏感性增加,与C6细胞同组的细胞抑制率比较有显著性差异(P<0.05),C6细胞和C6/IL-18细胞顺铂的IC50分别为55.49±11.04μg/ml和29.66±6.34μg/ml,经比较具有显著性差异(P<0.05)。　　 2.流式细胞术检测细胞凋亡,数据显示C6和C6/IL-18细胞的凋亡率分别为2.40±1.43％和8.72±2.16％,在加入IC50顺铂作用后其凋亡率分别10.57±1.93％和22.63±2.85％。数据经统计学分析,差异显著(P<0.05)。表明,IL-18基因本身能引起细胞凋亡；在加入药物后导致细胞凋亡进一步增加,提示IL-18基因能够提高胶质瘤细胞对顺铂的敏感性。　　 3.RT-PCR结果显示IL-18 mRNA在C6细胞中无表达,而在C6/IL-18细胞中表达明显。C6和C6/IL-18细胞MDR1 mRNA的光密度比值分别为0.54±0.06和0.11±0.01,经统计软件做单因素方差分析,C6/IL-18细胞MDR1 mRNA表达水平较C6细胞差异明显,具有统计学意义(P<0.05)。表明,IL-18基因能显著降低细胞MDR1基因的转录水平。　　 4.对Western-blot结果进行测量,C6和C6/IL-18细胞P-糖蛋白的光密度比值分别为0.40±0.04和0.09±0.02,做单因素方差分析,结果显示C6/IL-18细胞P—gp表达水平较C6细胞差异明显,具有统计学意义(<0.05)。说明,IL-18基因能显著降低细胞P-gp的表达水平。　　 结论:IL-18基因与顺铂结合可明显增加对胶质瘤细胞的抑制作用。其作用机理与IL-18基因下调多药耐药基因MDR1有关。该结果对于增加化疗药物的敏感性,减低药物的毒副作用,提高胶质瘤的治疗效果有一定的参考意义。