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间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)和 c-ros 原癌基因 1(c-ros oncogene 1,ROS1)均属于受体酪氨酸激酶家族成员,已被证实为非小细胞肺癌(non-small cell lung cance,NSCLC)原癌驱动基因。虽然针对 ALK、ROS1 和 c-MET的小分子抑制剂克唑替尼对ALK阳性或ROS1阳性NSCLC具有很好的临床疗效,但与其他靶向药物一样,患者在治疗1年左右均不可避免地会产生耐药性,所以新型ALK/ROS1抑制剂的研发和耐药机制的探讨是必须的也是必要的。前期通过对一系列新型ALK/ROS1双靶点抑制剂筛选,我们选取了抑制剂ZX-29进行深入研究。我们利用MTT、AO/EB染色、流式细胞术和蛋白免疫印迹技术等实验方法探讨了 ZX-29对棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)阳性的NCI-H2228细胞和SLC34A2-ROS1阳性的HCC78细胞的体外抗肿瘤作用。结果表明ZX-29能显著抑制NCI-H2228和HCC78细胞的增殖,将细胞阻滞在G0/G1期,并促进细胞凋亡,且抗肿瘤效果显著强于二代ALK抑制剂色瑞替尼和一代ROS1抑制剂克唑替尼。ALK或ROS1激酶区突变是最常见的耐药机制,在已证实的突变中,ALK的G1202R突变和ROSI G2032R突变是目前已知的耐药性最强的突变类型。为了探讨新型抑制剂ZX-29能否克服由于基因突变导致的细胞耐药性,我们利用分子克隆技术及融合PCR技术构建了 EML4-ALK G1202R和CD74-ROS1 G2032R突变重组质粒,随后用脂质体法将重组质粒转染到ALK和ROSI阴性的A549细胞株中,G418筛选构建突变稳转细胞模型。MTT及蛋白免疫印迹结果证明构建的突变细胞模型对克唑替尼耐药,表明成功构建突变耐药细胞株。随后我们检测了突变耐药细胞株对ZX-29的敏感性,结果表明ZX-29仍然能够有效地抑制突变耐药细胞的活性,且与ALK/ROS1未突变野生型细胞的IC50相近,表明ZX-29能够克服由基因突变导致的细胞耐药性。ALK型肺癌占NSCLC的3%-5%,而ROS1型肺癌仅占NSCLC的0.9%-1.7%左右。由于ROS1型肺癌仅占很小的比例,目前几乎没有关于ROS1的生物学功能及突变耐药机制的研究。本文在成功构建CD74-ROS1和CD74-ROS1 G2032R突变高表达细胞株的基础上,针对已构建细胞模型对ROS1及其突变耐药进行了深入研究。结果发现,CD74-ROS1或CD74-ROS1 G2032R的表达能够通过增加Twist1转录因子的表达,进而诱导细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),并显著增强了细胞的迁移和侵袭能力;抑制Twist1能够逆转细胞EMT,降低细胞的迁移和侵袭能力,并增强CD74-ROS1 G2032R突变耐药细胞对克唑替尼的敏感性,促进细胞凋亡。综上所述,ZX-29是一个新型的ALK/ROS1双靶点抑制剂,能够克服由于ALK/ROS1基因突变导致的细胞耐药性,本研究为开发ZX-29成为一个有前景的抗肿瘤药物提供了实验依据和理论基础,并为克服基因突变导致细胞耐药性提供了新的研究方向和策略。